抗體偶聯(lián)藥物（antibody-drug conjugate，ADC）是一類通過特定的連接子將靶向單克隆抗體與高殺傷性的細(xì)胞毒性小分子藥物偶聯(lián)起來的生物藥，以單克隆抗體為載體將小分子細(xì)胞毒性藥物高效地運輸至目標(biāo)腫瘤細(xì)胞中，起到治療的目的。
 

與傳統(tǒng)抗體藥相比，ADC藥物的結(jié)構(gòu)復(fù)雜度和異質(zhì)性更高，因為添加了多變的有效載荷和連接子¹。為確保藥物安全性和有效性，ADC的深度表征在其開發(fā)過程中至關(guān)重要。這不僅包括對mAb的翻譯后修飾（PTM）的鑒定和定位，還包括藥物偶聯(lián)的鑒定。由于質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展，質(zhì)譜已經(jīng)成為ADC藥物表征中最廣泛使用的方法。完整質(zhì)量分析是用于確定小分子藥物與抗體比率（DAR）的常規(guī)方法，而對結(jié)合位點的深入表征，通常依賴于bottom-up的方法。

現(xiàn)在最廣泛采用的碰撞誘導(dǎo)解離（CID）技術(shù)能夠提供氨基酸序列確認(rèn)，但是這種能量比較大的碎裂技術(shù)也將有效載荷碎裂為更小的片段，從這種方法獲得的高度復(fù)雜的譜圖可能很難解析。而能量更柔和的碎裂方法可以促進(jìn)此類復(fù)雜樣品的解析，一種基于電子活化裂解（EAD）^2,3的創(chuàng)新、高度可重復(fù)的碎裂方法用于分析來自商業(yè)化ADC藥物的偶聯(lián)肽。使用10 Hz快速非靶向的數(shù)據(jù)依賴采集（DDA）方法采集數(shù)據(jù)，通過此工作流程，一次進(jìn)樣就可以應(yīng)用基于EAD的碎片進(jìn)行常規(guī)和高級表征。

曲妥珠單抗美坦新偶聯(lián)物（T-DM1）是最早的ADC治療藥物之一，于2013年獲得FDA批準(zhǔn)用于治療人表皮生長因子受體2（HER2）陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌。T-DM1是由單克隆抗體曲妥珠單抗和細(xì)胞毒素美坦新（DM1）通過不可裂解連接子共價偶聯(lián)而成（圖1）。將單克隆抗體（mAb）的靶標(biāo)特異性與細(xì)胞毒性藥物的高效率相結(jié)合，可充分利用兩個方面的優(yōu)勢，最大限度地減少副作用³。T-DM1是與氨基連接，如連接在曲妥珠單抗的賴氨酸殘基的側(cè)鏈中。先前的完整質(zhì)量研究表明，T-DM1的平均DAR約為3.5.^1,4。但是曲妥珠單抗中有88個賴氨酸殘基和4個N端基團(tuán)，可能會出現(xiàn)450萬個以上的不同分子形式¹。有效載荷的位點和結(jié)構(gòu)將直接影響藥物的功效和安全性，因此將其歸類為關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA），并且需要在開發(fā)過程中進(jìn)行全面表征和嚴(yán)格監(jiān)控。

圖1. 細(xì)胞毒藥物有效載荷和連接子與mAb偶聯(lián)的示意圖。T-DM1由DM1（黑色），靶向連接氨基殘基的MCC連接子（linker，藍(lán)色）和單克隆抗體組成。

   
本研究選擇了與Zeno^™ EAD相結(jié)合的DDA方法。采用這種方法，不僅可以執(zhí)行常規(guī)的肽圖分析，而且EAD可以在同一針分析中進(jìn)行高級表征。此外，Zeno EAD增強了碎片離子的檢測能力，從而正確鑒定了低豐度物質(zhì)。圖2展示了在偶聯(lián)肽SCDK [DM1]THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK上觀察到的碎裂模式的例子。在分析中未觀察到?jīng)]有連接子和藥物或其部分的肽，表明其完全偶聯(lián)。獲得了此肽段高質(zhì)量的MS / MS譜圖，從而使該特定肽段的MS / MS序列覆蓋率達(dá)到96.6％。一個更占優(yōu)勢的碎片從 m/z大于500的有效載荷產(chǎn)生（請見圖2中的標(biāo)記）。觀察到的有效載荷結(jié)構(gòu)的主要裂解位點是DM1的COO-C鍵，這種碎裂模式與先前利用CID技術(shù)產(chǎn)生的一系列小碎片的數(shù)據(jù)不同¹。較大分子量的藥物碎片可以用作特征碎片，以更具體地確認(rèn)有效載荷的存在，并可以用來確認(rèn)有效載荷的結(jié)構(gòu)。

圖2. 應(yīng)用Zeno EAD得到的偶聯(lián)肽SCDK [DM1] THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK（z =+4）的碎片數(shù)據(jù)。來自肽段主鏈指定偶聯(lián)肽段離子的全掃描MS / MS數(shù)據(jù)，以及有效載荷中的碎離子信息。

此外，通過將Zeno EAD技術(shù)用于增強的碎片離子檢測，還可以很好地檢測到來自肽段主鏈的片段信息，從而提供有關(guān)肽段的分子完整性的信息。由于酶的空間位阻，抗體上偶聯(lián)藥物的存在會導(dǎo)致樣品制備酶解過程中的更多漏切位點。另外，賴氨酸殘基和有效載荷之間的結(jié)合過程是隨機(jī)反應(yīng)，偶聯(lián)的比率并不總是100％，這導(dǎo)致了多樣性和低豐度物質(zhì)存在。當(dāng)一個肽段中存在多個潛在連接形式時，鑒定正確的連接位點可能是一個挑戰(zhàn)。

肽段ASQDVNTAVAWYQQKPGKAPK是這種具有挑戰(zhàn)性的另一個例子（圖3）。它包含一個漏切位點和一個脯氨酸相鄰的N端賴氨酸，導(dǎo)致偶聯(lián)位點的多種選擇。但是，有了從EAD技術(shù)碎裂得到豐富、高質(zhì)量的MS / MS質(zhì)譜圖，就可以實現(xiàn)藥物定位的自動匹配（圖3A）。由于有效載荷靠近肽的C端，因此檢測到的C離子比Z離子豐富（圖3A），而未結(jié)合的肽顯示出來自C端和N端的豐富片段（圖3B）。眾所周知因為電子活化解離技術(shù)不會解離脯氨酸的N端，我們還檢測到了除了C15以外的從C3到C17的全系列C片段7。這提供了確鑿的證據(jù)表明K15未與細(xì)胞毒藥物偶聯(lián)。此外，z4，z5和z7表明K18（而非K21）是藥物偶聯(lián)的正確位點。

 

圖3. 應(yīng)用Zeno EAD得到的來自偶聯(lián)/非偶聯(lián)肽ASQDVNTAVAWYQQKPGK [DM1] APK（z =+3）的碎片的數(shù)據(jù)。A：來自肽段主鏈指定偶聯(lián)肽段離子的全掃描MS / MS數(shù)據(jù)，以及有效載荷中的碎離子信息。B：來自肽段主鏈指定非偶聯(lián)肽的全掃描MS / MS數(shù)據(jù)。 連接子顯示為藍(lán)色，DM1藥物顯示為黑色。
 

結(jié)論：

• 通過EAD的新型碎裂模式，實現(xiàn)了具有多個潛在位點的多肽中藥物偶聯(lián)的準(zhǔn)確定位

• 與傳統(tǒng)的MS / MS分析相比，EAD技術(shù)獲得更豐富的MS/MS碎片信息。應(yīng)用Zeno EAD技術(shù)，即使對于中等強度或極低強度的母離子（例如低豐度的偶聯(lián)肽），也能獲得令人信服的二級碎片和出色的數(shù)據(jù)質(zhì)量

• SCIEX ZenoTOF^™ 7600系統(tǒng)強大、高重現(xiàn)性且易于使用的多重碎裂技術(shù)，使用戶能夠以簡單的方式解決具有挑戰(zhàn)性的分析問題

應(yīng)用電子活化解離（EAD）技術(shù)
進(jìn)行抗體-藥物偶聯(lián)物（ADC）表征

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