脂肪組織可通過分泌激素來調節(jié)饑餓和體溫，在身體的關鍵功能中發(fā)揮積極作用。體內的脂肪有很多種：白色脂肪組織可儲存多余的能量，而棕色脂肪組織則消耗能量并產熱。米色脂肪則是一種新發(fā)現(xiàn)的脂肪組織，與棕色脂肪一樣具有產熱功能。

越來越多的證據(jù)表明，棕色和米色脂肪組織可以預防代謝疾病，比如胰島素抵抗和糖尿病。米色脂肪的增加與代謝健康的顯著改善有關。近日，哈佛醫(yī)學院貝斯以色列女執(zhí)事醫(yī)療中心等機構的研究人員開發(fā)出一種新方法來產生更多的米色脂肪細胞。

作者鑒定出一種關鍵的E3泛素連接酶Cul2-APPBP2，它能夠催化PRDM16蛋白的降解，而PRDM16蛋白是米色脂肪產生的有效激活因子。這項研究成果于8月17日發(fā)表在《Nature》雜志上。
 

圖片來源：Nature

研究材料與方法
在這項研究中，研究人員使用Cul2^flox/−小鼠、Appbp2^flox/−小鼠以及Appbp2（S561N）點突變小鼠（后兩種小鼠由賽業(yè)生物提供）來構建脂肪細胞特異性的Cul2-KO小鼠和Appbp2-KO小鼠。作者還采用shRNA干擾和過表達技術來分析Cul2和Appbp2基因的功能。在分析PRDM16蛋白穩(wěn)定性的調控機制時，作者綜合使用了蛋白質組學、轉錄組學和蛋白質互作分析等方法。

技術路線
01 脂肪細胞中的CUL2降低PRDM16蛋白的穩(wěn)定性
02 脂肪細胞中CUL2的缺失改善代謝健康
03 APPBP2作為CUL2–RING E3連接酶復合物中的底物受體
04 CUL2–APPBP2復合物催化PRDM16蛋白的多泛素化和降解
05 APPBP2控制全身能量代謝

研究結果
1.CUL2降低了PRDM16蛋白的穩(wěn)定性
多項研究表明，PR結構域蛋白16（the positive regulatory domain containing 16, PRDM16）通過與轉錄因子和表觀遺傳因子形成復合物來促進米色脂肪細胞的產生，因此成為改善代謝健康的熱門靶點。然而，由于缺乏對PRDM16蛋白表達調控機制的了解，選擇性靶向該通路來改善代謝變得很困難，于是研究人員試圖探索PRDM16蛋白的降解機制。

作者觀察到，NEDD8活化酶抑制劑MLN4924能夠大幅提高PRDM16蛋白水平，而不是mRNA水平；MLN4924是一種小分子抑制劑，能夠抑制蛋白質neddylation（類泛素化）修飾，這種修飾通過NEDD8靶向cullin–RING E3泛素連接酶復合體等來刺激泛素連接酶的活性。因此，作者開始尋找PRDM16蛋白的E3泛素連接酶復合物。

研究人員發(fā)現(xiàn)，在cullin–RING E3泛素連接酶家族成員（CUL1-7）中，只有CUL2和PRDM16的共表達才會導致PRDM16蛋白表達的降低，而不影響Prdm16 mRNA水平。此外，放線菌酮追蹤實驗表明，Cul2缺失顯著延長了PRDM16蛋白的半衰期，同時Cul2缺失對PRDM16蛋白的穩(wěn)定的影響顯著改變了脂肪細胞中的代謝級聯(lián)反應，但不影響脂肪生成。后續(xù)的RNA-seq分析表明，Cul2缺失可以促進PRDM16激活線粒體呼吸作用、脂肪酸氧化和支鏈氨基酸降解等在棕色/米色脂肪生命過程十分重要的反應，同時抑制脂肪組織炎癥和纖維化。這些結果顯示，CUL2的存在會降低PRDM16蛋白的穩(wěn)定性。

接下來，作者想確定脂肪細胞中的CUL2–RING E3連接酶可在多大程度上調節(jié)全身的能量代謝。作者構建了脂肪特異性的Cul2敲除（Adipo-Cul2-KO）小鼠。與對照相比，Adipo-Cul2-KO小鼠在高脂飲食后表達更高水平的PRDM16蛋白。脂肪細胞特異性的Cul2缺失抵消了高脂飲食誘導的小鼠肥胖、葡萄糖耐受不良、胰島素抵抗和血脂異常。這些結果表明，脂肪中CUL2的缺失可改善代謝健康。

2.APPBP2是連接CUL2和PRDM16的底物特異性受體
CUL2主要通過與幾種底物受體相互作用來發(fā)揮支架蛋白功能。為了鑒定PRDM16蛋白的特異性底物受體，研究人員對分化的米色脂肪細胞中的CUL2復合物進行免疫純化，并利用液相色譜串聯(lián)質譜（LC–MS/MS）對其進行分析，結合蛋白質組學數(shù)據(jù)分析和shRNA篩選，發(fā)現(xiàn)APPBP2的下調顯著提高了分化脂肪細胞中Ucp1 mRNA水平，該基因編碼了負責產熱的線粒體膜蛋白。

之后，作者開展了多個實驗來驗證CUL2–APPBP2催化PRDM16蛋白多泛素化的假設。蛋白質互作實驗的結果表明，APPBP2通過與ELOB和ELOC的相互作用與CUL2互作，而APPBP2直接與PRDM16相互作用。多泛素化反應實驗以及質譜和點突變分析證實了CUL2–APPBP2特異性催化PRDM16多泛素化。Appbp2的缺失減少了PRDM16多泛素化并顯著延長了PRDM16蛋白的半衰期（圖1）。這些數(shù)據(jù)表明，APPBP2是CUL2–RING E3連接酶復合物催化PRDM16的多泛素化和降解過程中的底物受體。
 

圖1 CUL2–APPBP2催化PRDM16的多泛素化^[1]
 

在接下來的實驗中，作者驗證了脂肪細胞特異性的APPBP2抑制促進米色脂肪產生的假設。作者委托賽業(yè)生物構建了Appbp2 floxed小鼠，并與Adiponectin-Cre小鼠雜交后產生脂肪細胞特異性的Appbp2敲除（Adipo-Appbp2-KO）小鼠。Appbp2缺失導致PRDM16蛋白水平升高，并伴隨著棕色/米色脂肪選擇性基因的表達增加。與對照相比，Appbp2-KO脂肪細胞表達更高水平的線粒體編碼基因。此外，研究人員還通過蛋白質組學、轉錄組學和細胞呼吸分析這三個互補實驗證實了CUL2-APPBP2催化PRDM16蛋白多泛素化的底物特異性。

3.美普他酚可增強抗病毒免疫力
在確定CUL2–APPBP2為PRDM16的E3泛素連接酶之后，作者進一步分析了PRDM16蛋白穩(wěn)定性的調控機制。之前的研究表明EHMT1會調控PRDM16蛋白的穩(wěn)定性和棕色/米色脂肪細胞的發(fā)育，在本文作者發(fā)現(xiàn)EHMT1通過PRDM16的蛋白結合界面以劑量依賴性的方式從PRDM16復合物中置換出APPBP2。重要的是，復合物中APPBP2的置換減少了PRDM16蛋白的多泛素化。同時，老年脂肪組織中的APPBP2和CUL2表達升高，而PRDM16和UCP1蛋白的表達則下降（圖2）。

之前的研究發(fā)現(xiàn)，APPBP2可能在代謝健康中發(fā)揮作用。于是，研究人員分析了Adipo-Appbp2-KO小鼠在高脂飲食后的代謝表型。作者發(fā)現(xiàn)，Appbp2-KO小鼠的體重明顯低于對照小鼠，且脂滴積累更少。與對照相比，這些小鼠的葡萄糖耐量和胰島素敏感性增加，而且肝臟中的甘油三酯水平更低。這些結果表明，脂肪組織中CUL2-APPBP2的缺失可防止飲食引起的肥胖、葡萄糖耐受不良、胰島素抵抗和血脂異常。
 

圖2 APPBP2控制全身能量代謝^[1]

研究結論
總的來說，這項研究提出了通過PRDM16蛋白穩(wěn)定性來控制米色脂肪產生的模型：CUL2–APPBP2 E3泛素連接酶復合物催化了PRDM16蛋白的多泛素化和降解（圖2i）。CUL2–APPBP2的抑制延長了PRDM16蛋白的半衰期，導致脂肪細胞中產熱基因的自主激活以及促炎/纖維化基因的抑制。研究人員認為，在各種病理生理狀況下如何調控CUL2–APPBP2–PRDM16的相互作用是未來研究的重要課題。

原文檢索：
[1]Wang, Q., Li, H., Tajima, K. et al. Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization. Nature 609, 151–158 (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05067-4
 

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Appbp2基因敲除小鼠

品系名稱：
C57BL/6J-Appbp2^em1Cya
品系編號：
KOCMP-66884-Appbp2-B6J-VA
產品編號：
S-KO-11974
應用方向：
免疫系統(tǒng)、皮膚、視力/眼睛
打靶方案：

Appbp2條件性基因敲除小鼠

品系名稱：
C57BL/6J-Appbp2^em1(flox)Cya
品系編號：
CKOCMP-66884-Appbp2-B6J-VA
產品編號：
S-CKO-13362
應用方向：
免疫系統(tǒng)、皮膚、視力/眼睛
打靶方案：