為了了解和再現(xiàn)肝細(xì)胞在其生理微環(huán)境中的細(xì)胞相互作用并生成人工3D體外模型，開發(fā)了一種使用3D擠出生物打印的共培養(yǎng)系統(tǒng)�；�于藻酸鹽和甲基纖維素 (algMC) 的生物墨水首次被證明適用于肝細(xì)胞的生物打印；向algMC添加Matrigel可增強(qiáng)它們?cè)趩蜗嘀Ъ苤械脑鲋澈托螒B(tài)。為了研究更復(fù)雜的細(xì)胞相互作用系統(tǒng)，我們應(yīng)用核殼生物打印技術(shù)為肝細(xì)胞建立定制的3D共培養(yǎng)模型。

研究所用打印機(jī)及耗材

在無菌條件下使用GeSiM公司的BioScaffolder 3.1型號(hào)生物3D打印機(jī)制作支架。使用壓縮空氣通過錐形給藥針(Nordson EFD, Germany)分配糊狀生物墨水;在12個(gè)以空氣為繪圖介質(zhì)的井板中，股線以一層一層的方式沉積，每層平行排列，層間方向偏移90°。

研究過程

HepG2在使用和不使用Matrigel的algMC打印結(jié)構(gòu)中的活性

為了研究封裝的HepG2的活性，生物打印和交聯(lián)構(gòu)建物培養(yǎng)了至少10天。在培養(yǎng)的不同時(shí)間點(diǎn)，用Calcein AM和EthD-1同時(shí)對(duì)支架內(nèi)的活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行染色。

圖1：使用和不使用Matrigel時(shí)，HepG2嵌入algMC的活力。(A)培養(yǎng)第2天、第7天和第10天嵌入打印支架的HepG2活/死染色的cLSM圖像�；罴�(xì)胞被染成綠色(鈣黃素)，而死細(xì)胞被染成紅色(同型二聚體-1);比例尺= 250μm。(B)兩種條件的存活率(存活集群與總集群的體積比)比較(n = 6，平均值±SD， ****p < 0.0001)。
 

使用和不使用Matrigel的algMC打印結(jié)構(gòu)中HepG2的形態(tài)和組織

為了觀察生物打印水凝膠支架內(nèi)細(xì)胞的形態(tài)和組織，在培養(yǎng)的不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架和細(xì)胞核進(jìn)行染色。

圖2：培養(yǎng)2、7和10天后，HepG2嵌入有(上)和無基質(zhì)(下)的algMC的形態(tài)和組織。細(xì)胞核染色為藍(lán)色(DAPI)，細(xì)胞骨架顯示為綠色(Phalloidin-iFluor 488染色肌動(dòng)蛋白);比例尺代表50μm.

核殼生物打印系統(tǒng)中肝細(xì)胞-成纖維細(xì)胞間接共培養(yǎng)的空間定義模式

在確定合適的水凝膠材料支持肝細(xì)胞在三維環(huán)境下生長和功能后，我們旨在研究它們?cè)谟珊藲?D生物圖譜制作的復(fù)雜共培養(yǎng)系統(tǒng)中的性能。
 

圖3：肝細(xì)胞-成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)概念的圖示，顯示被包裹在外殼中的肝細(xì)胞與核心的NIH 3T3成纖維細(xì)胞同軸打印，兩者在各自的生物墨水中作為單細(xì)胞共打印(左)。假設(shè)核心成分(含或不含成纖維細(xì)胞和基質(zhì)成分)對(duì)肝細(xì)胞表型的影響，因?yàn)樗鼈兛赡茉跉な抑猩�長成簇，成纖維細(xì)胞在培養(yǎng)期間擴(kuò)散形成網(wǎng)絡(luò)( 右)。使用Biorender.com軟件創(chuàng)建的圖像。

制造載有細(xì)胞的核殼鏈支架

采用出口直徑為800μm(殼)和400μm(芯)的同軸針制造核殼鏈。

圖4：殼層用800μm針繪制，芯層用400μm針繪制。(A)無細(xì)胞的核殼鏈的立體顯微圖像，呈曲流狀沉積，鏈內(nèi)核(algMC)和殼(algMC+ Matrigel)分隔清晰;(B)無細(xì)胞的打印支架的立體顯微圖像，核心處有藍(lán)色染色，用于通過同軸鏈可視化連續(xù)的核心室;插入物顯示通過鋼絞線段的截面，從腳手架刻度條上切割出2毫米。

圖5：培養(yǎng)第7天的代謝活性(通過MTT染色;紫色)的HepG2和NIH 3T3細(xì)胞嵌入核殼打印水凝膠支架;核-殼界面通過c中的白色虛線可見，上面的圖顯示HepG2被包裹在由algMC+Matrigel組成的殼室中，而核仍然是游離細(xì)胞。下圖顯示NIH 3T3細(xì)胞被包裹在由algMC組成的核心腔室中，而外殼仍然沒有細(xì)胞。(A,B)比例尺2 mm。(C)比例尺500µm。

在核殼鏈支架中同時(shí)嵌入HepG2和NIH 3T3細(xì)胞

為了在同時(shí)進(jìn)行生物打印后對(duì)兩種細(xì)胞類型進(jìn)行可視化，首先用預(yù)先標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。DiD標(biāo)記的肝細(xì)胞（紅色）被包裹在由algMC+Matrigel組成的外殼中，而DiI標(biāo)記的成纖維細(xì)胞（藍(lán)色）被包裹在由algMC組成的核心中。然后將這些支架與單一培養(yǎng)支架進(jìn)行比較，后者只在外殼中有did標(biāo)記的肝細(xì)胞，核心中沒有細(xì)胞。

圖6：核殼鏈支架中HepG2和NIH 3T3的空間分布。(A,B)支架中條帶的熒光圖像顯示HepG2/NIH 3T3共培養(yǎng)與HepG2單培養(yǎng)支架中被包被細(xì)胞的分布;比例尺200μm。白色虛線表示整個(gè)鏈的寬度。(C)培養(yǎng)第4天核殼鏈共培養(yǎng)支架的熒光圖像顯示綠色的鈣黃素染色活細(xì)胞;為了顯示核心，覆蓋青色通道(dii標(biāo)記的NIH 3T3);比例尺1000μm。

圖7：HepG2與NIH 3T3共培養(yǎng)及在核殼鏈支架中單獨(dú)培養(yǎng)的活性及定位。共聚焦圖像顯示，已標(biāo)記的HepG2(紅色)被包裹在由algMC+基質(zhì)組成的殼室中，NIH 3T3成纖維細(xì)胞被包裹在algMC核中，并用DiI(青色)標(biāo)記(上圖)或無細(xì)胞的algMC核(下圖)。活細(xì)胞用Calcein-AM（綠色）染色。圖顯示了肝細(xì)胞在培養(yǎng)期間細(xì)胞簇形成的進(jìn)展。比例尺(第1天)500μm;比例尺(第7、14天)300μm;白色虛線在這里表示核-殼接口。

核心生物墨水的功能化--增強(qiáng)成纖維細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的形成

由于我們假設(shè)成纖維細(xì)胞的表型直接影響與肝細(xì)胞的相互作用，下一步是研究功能化生物墨水對(duì)NIH 3T3表型的影響。

圖8：共培養(yǎng)第7天，成纖維細(xì)胞在核心室形成網(wǎng)絡(luò)。核-殼水凝膠鏈共聚焦圖像，在algMC+基質(zhì)殼中包裹有did標(biāo)記的HepG2(紅色)，在algMC核中嵌有dii標(biāo)記的NIH 3T3成纖維細(xì)胞(青色)，algMC補(bǔ)充了纖維蛋白，algMC補(bǔ)充了血漿�；罴�(xì)胞被Calcein AM染成綠色，表明纖維蛋白和血漿功能化核心內(nèi)形成了成纖維細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，而未修飾的algMC核心中保持成纖維細(xì)胞的圓形形態(tài)。上面的瓦片給出了核殼鏈的一個(gè)部分的概述;放大倍率5倍，比例尺500μm。下圖顯示核心的NIH 3T3成纖維細(xì)胞放大倍數(shù)(10倍)圖像;比例尺400μm。

微環(huán)境對(duì)核殼生物打印共培養(yǎng)系統(tǒng)中肝臟標(biāo)記蛋白表達(dá)的影響

肝細(xì)胞的功能通常通過其合成和分泌特定蛋白質(zhì)的能力來評(píng)估。因此，為了研究在不同核心材料中生長的成纖維細(xì)胞對(duì)鄰近殼室肝細(xì)胞的影響，我們通過抗體染色和隨后的免疫熒光顯微鏡觀察不同條件下特異性標(biāo)記蛋白的表達(dá)。

圖9：單核細(xì)胞培養(yǎng)中(無細(xì)胞的algMC核;I)和NIH 3T3成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)嵌入不同成分的核心室(II-IV)。(A) HepG2蛋白(紫色)、細(xì)胞核(藍(lán)色)和細(xì)胞骨架(綠色)染色共聚焦圖像;比例尺50μm。(B) HepG2的CK-19(黃色)、細(xì)胞核(藍(lán)色)和細(xì)胞骨架(紅色)染色共聚焦圖像;比例尺50μm。(C) HepG2的AAT(綠色)、細(xì)胞核(藍(lán)色)和細(xì)胞骨架(紅色)染色共聚焦圖像;比例尺50μm。

開發(fā)的水凝膠系統(tǒng)的流變學(xué)和機(jī)械性能

為了進(jìn)一步表征改性水凝膠共混物的打印后和交聯(lián)性能，我們對(duì)單相支架進(jìn)行了單軸壓縮試驗(yàn)，以研究三維結(jié)構(gòu)在繪圖和后處理后的機(jī)械穩(wěn)定性和剛度。

圖9：打印和交聯(lián)后單相和核殼鏈支架的機(jī)械特性。( A )交聯(lián)單相支架在第1天的應(yīng)力-應(yīng)變曲線。( B ) 交聯(lián)的單氣態(tài)腳手架在第1天的壓縮模量。( C ) 交聯(lián)的核殼支架在第1天時(shí)的應(yīng)力-應(yīng)變曲線，其核心成分algMC+Matrigel 殼中是不同的。( D ) 交聯(lián)核殼支架在第1天的壓縮模量（n = 4，p*** < 0.0005，平均值±SD）。

為了構(gòu)建肝組織模型，以核-殼方式共培養(yǎng)成纖維細(xì)胞是了解這種共培養(yǎng)生物打印策略的巨大潛力的第一步。為了開發(fā)體外肝臟模型，開發(fā)與其他細(xì)胞類型的共培養(yǎng)系統(tǒng)將是我們未來工作的目標(biāo)，在此演示如何使用核-殼技術(shù)使我們能夠?yàn)樯�物打印�?xì)胞設(shè)計(jì)定制的3D微環(huán)境。為了模擬由血管和相互連接的血管組成的生理肝臟結(jié)構(gòu)，下一步將進(jìn)一步增加開發(fā)用于肝細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞和其他支持細(xì)胞類型共培養(yǎng)的打印結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性。這將使我們能夠研究這些3D系統(tǒng)中的細(xì)胞相互作用，并建立可灌注的肝臟模型。

圖10：肝細(xì)胞共培養(yǎng)概念的圖形表示，顯示了體內(nèi)的肝小葉是如何由血管、導(dǎo)管和管道（脈管）組成的，如上圖所示，這些血管、導(dǎo)管和管道被肝細(xì)胞片所包圍。因此，模擬肝小葉微結(jié)構(gòu)的概念被設(shè)想為打印在外殼上的肝細(xì)胞和排列在可灌注結(jié)構(gòu)核心的內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng)模型(下圖)。中間插圖來自 Cornell, B. 2016。肝小葉。

研究結(jié)論

研究中我們提出了基于3D擠壓的生物打印作為一種有前途的工具來生成具有生物活性的肝組織模型。通過對(duì)生物墨水成分的特定適應(yīng)，以及以核殼方式應(yīng)用兩種不同生物墨水的同軸打印，可以控制和調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的3D微環(huán)境，以模擬特定的條件。我們采用核殼鏈/支架設(shè)計(jì)，建立了肝細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的功能共培養(yǎng)模型。通過比較不同的墨水成分(含或不含生物活性成分的algMC)以及共培養(yǎng)與單培養(yǎng)，我們可以在我們的概念驗(yàn)證研究中展示空間定義的3D微環(huán)境的變化成分對(duì)肝細(xì)胞增殖和所選肝細(xì)胞特異性標(biāo)記物表達(dá)水平的強(qiáng)烈影響。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了定制3D微環(huán)境以生成人工肝臟結(jié)構(gòu)的重要性，以及為此目的的多功能生物打印技術(shù)的巨大潛力。需要論文全文的可以聯(lián)系我們獲取，謝謝！