Western botting實(shí)驗(yàn)中，樣品一旦準(zhǔn)備好，樣品蛋白質(zhì)通過  PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）分離，這可以在天然或變性條件下進(jìn)行。蛋白質(zhì)印跡指南的這一部分詳細(xì)介紹了您在分離蛋白質(zhì)時(shí)可能需要考慮的事項(xiàng)。

本文主要涉及以下幾個(gè)方面：
·  聚丙烯酰胺凝膠
·  緩沖液 pH值
·  用分子量標(biāo)記確定蛋白質(zhì)大小
·  陰性組織對(duì)照
·  上樣對(duì)照

SDS-PAGE通常用于WB實(shí)驗(yàn)，其中蛋白質(zhì)被變性及還原以獲得它們的初級(jí)結(jié)構(gòu)。用SDS分子（Sodium dodecyl sulfate）包被會(huì)產(chǎn)生與其分子量成正比的相對(duì)負(fù)電荷，從而允許僅按大小分離蛋白質(zhì)。Native PAGE的使用（不加入SDS 疏基乙醇等變性劑的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳），一般常用于觀察不同的蛋白質(zhì)特征。它很少被進(jìn)一步使用在WB實(shí)驗(yàn)中，更常見的是用考馬斯或銀染色。Native PAGE中的蛋白質(zhì)遷移率取決于電荷和流體動(dòng)力學(xué)的大小，這些因素都是由多肽折疊決定的。以特定方式折疊的小蛋白質(zhì)可能比更大、更緊密折疊的多肽具有更大的流體動(dòng)力學(xué)尺寸。此外，可以保留多聚體結(jié)構(gòu)。

SDS-PAGE是通過將蛋白質(zhì)引入丙烯酰胺凝膠基質(zhì)并施加電流將帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)拉過凝膠來運(yùn)作的。丙烯酰胺凝膠基質(zhì)的密度阻礙了蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。較小的蛋白質(zhì)比較大的蛋白質(zhì)能夠更快地通過凝膠，在電泳期間通過凝膠更遠(yuǎn)，并且看起來更接近凝膠的末端。相反，較大的蛋白質(zhì)抵抗遷移并保持更接近凝膠的開始。包含已知大小的蛋白質(zhì)marker可以與樣品同時(shí)上樣，以校準(zhǔn)分離蛋白質(zhì)的大小。

也可以使用其他類型的凝膠，這些凝膠通過大小以外的特性分離蛋白質(zhì)。例如，等電聚焦凝膠 (IEF) 凝膠根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn) (pI) 分離蛋白質(zhì)，該等電點(diǎn)對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)不帶凈電荷的 pH 值。除了凝膠本身之外，這些其他類型的凝膠通常還需要專門的緩沖液和分子量標(biāo)記。

將蛋白質(zhì)樣品裝入樣品孔中，在夾在兩個(gè)緩沖液室之間的聚丙烯酰胺凝膠中形成細(xì)⻮。垂直電泳儀如圖 1 所示。
 

圖 1. 垂直電泳儀

第一個(gè)室連接到陰極，樣品上樣孔暴露在此處，第二個(gè)室連接到凝膠末端的陽極。施加電壓，蛋白質(zhì)通過凝膠向陽極移動(dòng)。

蛋白質(zhì)大小和凝膠基質(zhì)的密度決定了分離的速度；較小的蛋白質(zhì)比較大的蛋白質(zhì)遷移得更快。

準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)定性和定量需要高質(zhì)量的分離，因此需要選用適當(dāng)?shù)哪�膠特性和上樣濃度來確保蛋白質(zhì)的充分分離。

聚丙烯酰胺凝膠

1. 聚丙烯酰胺凝膠用作分離基質(zhì)

堅(jiān)固、親水、熱穩(wěn)定、透明和相對(duì)化學(xué)惰性的性質(zhì)，確保了凝膠在過程中不會(huì)破裂或熔化，并且蛋白質(zhì)很容易被觀察到�；瘜W(xué)反應(yīng)不會(huì)干擾蛋白質(zhì)的遷移，并且由凝膠密度控制的孔徑可以變化。

2. 不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠

PAGE 中使用的大多數(shù)凝膠由兩個(gè)凝膠區(qū)域形成：由較低密度凝膠制成的濃縮凝膠和較高密度的分離凝膠。

較小的蛋白質(zhì)通過濃縮膠快速遷移，并阻礙了通過分離膠的遷移；較大的蛋白質(zhì)通過濃縮膠緩慢遷移，并且可能并不會(huì)滲透到分離膠中。

3. 梯度凝膠

梯度凝膠用于在同一實(shí)驗(yàn)中分離不同分子量范圍的蛋白質(zhì)，從而允許從同一樣品中分離低分子量和高分子量蛋白質(zhì)。凝膠的選擇取決于需要分離的蛋白質(zhì)。

4. 聚合和澆注凝膠

聚丙烯酰胺凝膠是通過化學(xué)或光引發(fā)聚合丙烯酰胺單體和 N,N-亞甲基雙丙烯酰胺交聯(lián)劑的溶液制成的。聚合的化學(xué)引發(fā)使用過硫酸銨等化合物引發(fā)反應(yīng)，使用 N,N,N ,N-四亞甲基二胺等化合物來穩(wěn)定鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。聚合的光引發(fā)使用核黃素，將其添加到溶液中并暴露在玻璃板之間的長波紫外線下，并用水飽和的丁醇覆蓋。

5. 高分子量蛋白質(zhì)

PAGE 可用于分離5至200 kDa 的蛋白質(zhì)。對(duì)于大分子量蛋白質(zhì)（700–4,200 kDa），瓊脂糖凝膠比聚丙烯酰胺凝膠更適合用于分離蛋白。

表 1. 不同重量蛋白質(zhì)的丙烯酰胺凝膠密度適用性。

緩沖液pH值

pH值影響蛋白質(zhì)遷移；因此，上樣緩沖液的pH值必須高于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，以維持它們的凈負(fù)電荷，它們才會(huì)向陽極移動(dòng)。連續(xù)密度凝膠在兩個(gè)腔內(nèi)使用相同的緩沖液，而不連續(xù)密度凝膠則需要一個(gè)不連續(xù)的緩沖系統(tǒng)。通常使用Tris-glycine緩沖液，其堆積凝膠pH值約為7.0，溶解凝膠pH值在8.0 - 9.0之間。當(dāng)需要時(shí)，可以使用其他專門的緩沖系統(tǒng)。例如，當(dāng)分離分子量非常低的蛋白質(zhì)/多肽時(shí)，Tricine緩沖液是理想的。

在高pH值溶解凝膠中，半胱氨酸殘基之間可以形成二硫鍵。為了解決這個(gè)問題，可以在緩沖液中加入還原劑。如果使用Native PAGE，可以添加一種兩性離子氨基酸，如tricine，其緩沖pH值范圍為7.4至8.8，作為替代溶液。

用分子量Marker確定蛋白質(zhì)大小

蛋白質(zhì)大小根據(jù)分子量Markers進(jìn)行校準(zhǔn)。這些Markers由一系列具有已知分子量的蛋白質(zhì)組成，這些蛋白質(zhì)與樣品同時(shí)在平行泳道中運(yùn)行。

未知多肽的分子量可以通過計(jì)算標(biāo)記物的相對(duì)遷移距離 (Rf) 與目標(biāo)蛋白跑膠的距離相比較來估計(jì)。分子量標(biāo)記也是蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移效率的有效指標(biāo)。

預(yù)染分子量標(biāo)記可用于監(jiān)測電泳過程中蛋白質(zhì)遷移的進(jìn)程。在添加免疫試劑之前，還可以通過用染料（例如立春紅）暫時(shí)染色膜來觀察標(biāo)記物。如果凝膠不進(jìn)行免疫印跡，可以在電泳后用考馬斯亮藍(lán)或銀染色來觀察未標(biāo)記的標(biāo)記物。
 

圖2. 跑膠過程中可能遇到的問題和對(duì)應(yīng)的解決辦法

陰性組織對(duì)照

陰性對(duì)照使用已知不表達(dá)靶蛋白的細(xì)胞或組織樣本。當(dāng)這些與需檢測的未知樣品一起上樣時(shí)，正確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)該顯示為沒有與目標(biāo)蛋白大小相同的對(duì)照帶。

進(jìn)行陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)的目的是識(shí)別一抗的非特異性結(jié)果。如果陰性對(duì)照顯示出條帶，那么則表示實(shí)驗(yàn)中的一抗與樣品中的其他蛋白（如培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的內(nèi)源性蛋白質(zhì)）發(fā)生了相互作用，而不是與靶蛋白發(fā)生相互作用。

另一種有效的陰性對(duì)照是進(jìn)行沒有一抗的免疫印跡實(shí)驗(yàn)，通常稱為無一抗對(duì)照。假如在此類對(duì)照實(shí)驗(yàn)中顯示出陽性對(duì)照，那么則表明二抗與樣品中的蛋白質(zhì)發(fā)生了相互作用。例如，進(jìn)行小鼠組織樣本的WB實(shí)驗(yàn)，并使用HRP偶聯(lián)的抗小鼠二抗時(shí)，假如樣本中含有小鼠IgG，則將會(huì)與二抗試劑產(chǎn)生相互作用。

上樣對(duì)照

上樣對(duì)照用于檢測PAGE 的一致性，該對(duì)照實(shí)驗(yàn)中觀察到的信號(hào)可用于在定量過程中使孔之間的測定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化。

上樣對(duì)照的一種形式是測量來⾃每個(gè)樣品中摻入的蛋白質(zhì)的信號(hào)。這可用于確認(rèn)在電印跡過程中從凝膠均勻轉(zhuǎn)移到膜上，并可用于在分析過程中使孔之間的信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化。在組成樣品的組織或細(xì)胞中表達(dá)的管家蛋白，例如肌動(dòng)蛋白，可用作上樣對(duì)照。特別是，他們確認(rèn)孔中裝載了相同數(shù)量的樣品，并且可以識(shí)別樣品處理差異。