監(jiān)測實時分析在Cell首次揭秘溶酶體氫離子通道的應(yīng)用

瀏覽次數(shù)：1033　發(fā)布日期：2022-7-13　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

北京時間2022年6月23日晚23時，在發(fā)表于Cell雜志的一項研究中，美國密歇根大學(xué)安娜堡分校徐浩新（Haoxing Xu）團隊鑒定出首個溶酶體膜上的氫離子通道TMEM175，并發(fā)現(xiàn)TMEM175在調(diào)控溶酶體酸堿平衡的重要作用——處于激活狀態(tài)的TMEM175能夠介導(dǎo)過量的氫離子溢出溶酶體，從而避免溶酶體內(nèi)部處于過酸性狀態(tài)。

徐浩新教授和胡美欽博士為論文共同通訊作者，胡美欽博士、李平博士和王策博士為共同第一作者

作為細(xì)胞中的“回收站”，溶酶體在細(xì)胞健康代謝中發(fā)揮著重要作用。而溶酶體內(nèi)部偏酸性的pH環(huán)境（pH~4.6），又是保障溶酶體持續(xù)正常運轉(zhuǎn)的基礎(chǔ)。那么溶酶體內(nèi)部pH的穩(wěn)態(tài)究竟是如何維持的呢？質(zhì)子泵V-ATPase自然居功至偉。此前，V-ATPase復(fù)合物已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)可以通過一系列精妙的調(diào)節(jié)機制，實現(xiàn)對溶酶體內(nèi)外pH穩(wěn)態(tài)的維持。這套復(fù)雜的分子機器能夠利用ATP水解產(chǎn)生的能量，源源不斷地將細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的氫離子逆濃度梯度泵入溶酶體內(nèi)部，從而為溶酶體營造出一片酸性的環(huán)境。除此之外，研究者們一直認(rèn)為存在未被鑒定的氫離子通道來介導(dǎo)氫離子快速外流，并和V-ATPase協(xié)同來調(diào)節(jié)溶酶體的酸堿平衡。

這一研究的靈感來源于徐浩新教授團隊很早以前的一個發(fā)現(xiàn)：他們在對細(xì)胞內(nèi)溶酶體膜直接進行電生理記錄時，只要溶酶體膜內(nèi)外仿照生理條件存在pH差別（膜外為pH=7.2的中性環(huán)境，膜內(nèi)為pH=4.6的酸性環(huán)境），就總是能夠記錄到特異的從膜內(nèi)流向膜外的微弱電流。假如將膜內(nèi)pH調(diào)整為更加酸性的3.5，這一信號會更加強烈。基于這一觀測，作者大膽猜測介導(dǎo)該電流的離子通道即是科學(xué)家們苦苦追尋的溶酶體膜上的氫離子通道，與V-ATPase質(zhì)子泵互相配合，一進一出，共同調(diào)節(jié)溶酶體的pH平衡。

為了找出這一“預(yù)測存在”的溶酶體氫離子通道蛋白，作者對一系列可能的溶酶體膜蛋白逐一進行過表達測試，最終，在排除了數(shù)十個蛋白后，發(fā)現(xiàn)當(dāng)膜蛋白TMEM175被過量表達時，所記錄到的“氫離子電流”竟比對照組高出了20倍之多；與此同時，利用CRISPR-Cas9技術(shù)將TMEM175基因進行敲除后，即使設(shè)定溶酶體膜內(nèi)pH為更酸的 3.5的情況下也記錄不到任何電流信號。這些結(jié)果表明，TMEM175就是那個介導(dǎo)氫離子進出溶酶體的離子通道�？山�(jīng)過查閱文獻卻發(fā)現(xiàn)，此前圍繞TMEM175的研究工作普遍認(rèn)為這是一個鉀離子通道。那么問題來了，該如何解釋兩者之間的差異呢？

經(jīng)過對比，他們注意到兩者所采用的實驗條件卻存在著一個本質(zhì)的不同：先前文獻在研究TMEM175時，忽略了pH對通道功能的調(diào)節(jié)作用，進而認(rèn)為TMEM175主要通透的是鉀離子；而胡美欽等人則是在將溶酶體內(nèi)部pH調(diào)節(jié)為更接近生理環(huán)境的酸性的條件下開展的一系列實驗——他們確認(rèn)：在此生理酸性條件下，通過TMEM175的離子主要為氫離子，而非鉀離子，經(jīng)過定量計算，得出TMEM175對氫離子的通透性是鉀離子的約五萬倍。

更加令人振奮的是，他們還首次鑒定出可以激活TMEM175通道的小分子化合物DCPIB和ML 67-33。這些化合物不僅能激活通道的氫離子電流，在中性條件下也同樣可以激活鉀離子電流。此外他們還發(fā)現(xiàn)內(nèi)源的脂質(zhì)分子花生四烯酸（Arachidonic Acid, ArA）是TMEM175通道內(nèi)源的激活劑，提示脂質(zhì)信號通路很可能對TMEM175的活性存在調(diào)節(jié)作用。這些激動劑均可以特異性的激活TMEM175通道來釋放溶酶體內(nèi)的氫離子（溶酶體內(nèi)pH上升），所以TMEM175成為可以用來調(diào)節(jié)溶酶體酸堿度的新靶點

為了進一步探究離子通道TMEM175的調(diào)控機制，作者將溶酶體內(nèi)部調(diào)整為中性pH、將溶酶體外部調(diào)整為酸性pH，發(fā)現(xiàn)此時即使空有氫離子濃度梯度，卻無法記錄到氫離子電流，表明溶酶體內(nèi)部的氫離子對于TMEM175激活必要性，即TMEM175可以被氫離子本身激活。

雖然在過表達的情況下可以在部分細(xì)胞上記錄到TMEM175鉀電流，但是內(nèi)源性的TMEM175卻沒有表現(xiàn)出可被記錄到的鉀電流，而激動劑DCPIB和花生四烯酸卻可以激活出明顯的鉀電流，所以TMEM175并不是如之前所認(rèn)為的自然開放的鉀離子通道，而是一種新型的具備門控機制的氫離子通道，并在中性或堿性環(huán)境以及激動劑存在的條件下具備鉀離子通透能力

通過突變篩選，當(dāng)TMEM175蛋白中第41個氨基酸由帶負(fù)電的的天冬氨酸突變?yōu)橹行缘谋彼幔ㄓ洖镈41A突變體）時，TMEM175完全失去了酸性條件下通透氫離子的能力，但中性條件下通透鉀離子的能力得到了保留。利用D41A突變體，可以得出結(jié)論：TMEM175的氫離子的通透性，而不是鉀離子的通透性，是調(diào)控溶酶體pH相關(guān)功能的關(guān)鍵所在。

近年來，研究者在帕金森綜合征的病人體內(nèi)普遍檢測到了TMEM175基因的突變，能進一步探索TMEM175功能更為廣闊的生理學(xué)意義。

首先，在細(xì)胞水平，TMEM175基因敲除細(xì)胞內(nèi)溶酶體的pH穩(wěn)態(tài)被破壞，溶酶體處于一種“酸性過強”的狀態(tài)，同時溶酶體內(nèi)部的蛋白水解酶Cathepsin B和Cathepsin D活性受到影響。其次，動物模型中，研究者構(gòu)建了TMEM175基因敲除小鼠，在小鼠神經(jīng)元中同樣觀察到了溶酶體酸性過強、溶酶體降解功能受損的現(xiàn)象。同時，與神經(jīng)退行性疾病帕金森癥致病相關(guān)的α-Synuclein聚積現(xiàn)象在TMEM175基因敲除小鼠中也更為顯著。

綜上所述，本項研究開辟了溶酶體pH調(diào)節(jié)的新方向，首次鑒定出溶酶體膜上的氫離子通道：TMEM175是一種新型的氫離子激活的氫離子通道。未來，我們期待更多圍繞TMEM175調(diào)節(jié)機制的精彩工作，以及TMEM175在神經(jīng)退行性模型中所扮演的角色！

活體化學(xué)物質(zhì)實時檢測系統(tǒng)可在動物清醒狀態(tài)下實施監(jiān)測多巴胺，抗壞血酸，鉀離子，腎上腺素，硫化氫，鈣離子，過氧化氫，氧氣，PH值，鎂離子，葡萄糖，乳酸等化學(xué)物質(zhì)。