CNTest中藥行業(yè)黃曲霉毒素免疫親和柱使用操作說明書
CNtest黃曲霉毒素總量免疫親和柱-中藥專用
（產品編號：QHZ103-ZY）
使用對象
CNtest免疫親和柱由中檢維康完全自主開發(fā)的系列產品，廣泛地應用于中藥、糧食、食品、飼料、堅果、植物油、調味品和酒類等樣品的檢測，該方法具有操作簡單、準確性高，靈敏度高等特點。
CNtest黃曲霉毒素免疫親和柱-中藥專用柱是根據(jù)《中國藥典2020版-2351真菌毒素測定法》獨立開發(fā)的產品，它適用于藥典中黃曲霉毒素親和柱檢測方法。同時我們對部分檢測方法進行了優(yōu)化，為大家提供更好的解決方案。
原理
樣品經提取液提取、過濾、稀釋，然后通過鍵合有黃曲霉毒素特殊抗體的免疫親和柱。此時，黃曲霉毒素被親和柱中的抗體特異性的吸附，用水或緩沖液將免疫親和柱上的雜質除去，然后用甲醇使抗體變性，從而將黃曲霉毒素從親和柱上洗脫下來。最后，用HPLC或熒光計進行定量檢測。
儲存條件
該親和柱保存在2-8 °C條件下，絕對不能冷凍，保質期為18個月。建議在室溫（18-30°C）下使用。
實驗溶液制備
1) 提取液，甲醇/水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水，混合均勻。
2) 提取液，乙腈/水（9+1）：取90mL乙腈加10mL水，混合均勻。
3) HPLC流動相，甲醇-乙腈-水（20+18+62，v/v）：取200mL甲醇、180mL乙腈、620mL水，混合均勻，用0.22微米的尼龍篩過濾。
4) 標準溶液的配制：取黃曲霉毒素混標（46304-U，B1和G1為1.0ug/mL,B2和G2為0.3ug/mL），甲醇為稀釋液，配制標準品溶液。例如：取100uL標準品原液于10mL容量瓶中，用甲醇定容至10mL，那么，黃曲霉毒素B1和G1為10ng/mL，黃曲霉毒素B2和G2為3ng/mL.
注：配制好的標準品溶液2-8℃冷藏保存有效期為24h。
5) 淋洗緩沖液，pH 7.0 PBS溶液：稱取8.0g氯化鈉，1.2g磷酸氫二鈉，0.2g磷酸二氫鉀，0.2g氯化鉀，用990mL純水溶解，然后用濃鹽酸調節(jié)pH值至7.0，最后用純水稀釋至1000mL。
或 量取100mL 10X Clover淋洗緩沖液（貨號：C3007）用900mL純水稀釋，混勻。
6) 0.5%的吐溫/PBS：將5.0mL吐溫-20加入到1L pH 7.0 PBS溶液中，混勻。
或 量取100mL 10X 0.5%的吐溫-20/pH7.0 PBS（貨號：C3008）用900mL純水稀釋，混勻。
液相色譜條件
色譜柱：Cloversil-C18 4.6*150mm（5um）或4.6*250mm（5um）
流動相：甲醇-乙腈-水（20+18+62，v/v）
流速：0.8mL/min
檢測器：熒光檢測器，激發(fā)波長360nm,發(fā)射波長450nm
進樣體積：20~100uL
光化學衍生化系統(tǒng)：光化學衍生器（254nm）
分析步驟
1 2020版-2351真菌毒素測定法-黃曲霉毒素測定法第一法和第二法：
1.1樣品提取及稀釋：
準確稱取試樣15.0g于均質杯中，加入3g氯化鈉，準確加入75.0mL甲醇-水（7+3），以均質器高速攪拌提取2min（攪拌速度大于11000r/min）。普通濾紙過濾或4000RPM離心5min，準確移取15.0mL濾液或上清液置于50mL容量瓶中，用純水稀釋至50mL, 混勻。用玻璃纖維濾紙過濾，至濾液澄清，量取20mL濾液備用；或 4000RPM離心10min，量取20ml上清液備用。
1.2樣品的凈化
將免疫親和柱連接于20.0mL玻璃注射器下。準確量取20mL處理好的樣品濾液或上清液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調節(jié)壓力使溶液以約3mL/min（1滴/秒）流速緩慢通過免疫親和柱，直至2~3mL空氣通過柱體。以3mL/min（1-2滴/秒）流速用10.0mL水淋洗柱子2次（必要時可以用淋洗緩沖液10mL淋洗，再用水10mL淋洗），棄去全部流出液，并使2mL~3mL空氣通過柱體。準確加入1.0mL色譜級甲醇洗脫，控制2mL/min（1滴/秒）流速，收集全部洗脫液，混勻，注入HPLC檢測。
2 中檢維康優(yōu)化方法：
1.1樣品提取及稀釋：
準確稱取試樣5.0g于50mL離心管中，加入1g氯化鈉，準確加入25.0mL乙腈-水（9+1），以均質器高速攪拌提取2min（攪拌速度大于11000r/min）。普通濾紙過濾或4000RPM離心5min，準確移取3.0mL濾液或上清液置于50mL離心管中，加入27mL0.5%的吐溫/PBS稀釋，混勻。用玻璃纖維濾紙過濾，至濾液澄清，量取20mL濾液備用。
1.2樣品的凈化
將免疫親和柱連接于20.0mL玻璃注射器下。準確量取20mL處理好的樣品濾液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調節(jié)壓力使溶液以約3mL/min（1滴/秒）流速緩慢通過免疫親和柱，直至2~3mL空氣通過柱體。以3mL/min（1-2滴/秒）流速用10.0mL水淋洗柱子，棄去全部流出液，并使2mL~3mL空氣通過柱體。準確加入2.0mL色譜級甲醇洗脫（注：可以用1ml甲醇洗脫，提高方法檢測靈敏度），控制2mL/min（1滴/秒）流速，收集全部洗脫液，混勻，注入HPLC檢測。
注意事項
1) 樣品添加回收試驗時，標準品添加到樣品中，靜置2小時后或過夜，再進行樣品前處理，否則會出現(xiàn)回收率偏低的現(xiàn)象。
2) 不要隨便更改操作說明書中的操作步驟，如需更改要和本公司技術部聯(lián)系，確認更改是否合理。
3) 操作步驟中，樣品過柱，淋洗，洗脫時，一定要控制好流速，不能太快，否則會使檢測結果偏低。
4) 如果將標準品直接過柱驗證回收率時，一定要確保標準上柱液中甲醇濃度不要超過25%，乙腈濃度不要超過20%，否則會影響柱子的吸附能力。
5) 試驗中使用的玻璃儀器等，一定要清洗干凈，尤其是用次氯酸等處理過的儀器，否則會使檢測結果偏低。
需要準備的設備及試劑（中檢維康提供）
（產品編號：QHZ103-ZY）
使用對象
CNtest免疫親和柱由中檢維康完全自主開發(fā)的系列產品，廣泛地應用于中藥、糧食、食品、飼料、堅果、植物油、調味品和酒類等樣品的檢測，該方法具有操作簡單、準確性高，靈敏度高等特點。
CNtest黃曲霉毒素免疫親和柱-中藥專用柱是根據(jù)《中國藥典2020版-2351真菌毒素測定法》獨立開發(fā)的產品，它適用于藥典中黃曲霉毒素親和柱檢測方法。同時我們對部分檢測方法進行了優(yōu)化，為大家提供更好的解決方案。
原理
樣品經提取液提取、過濾、稀釋，然后通過鍵合有黃曲霉毒素特殊抗體的免疫親和柱。此時，黃曲霉毒素被親和柱中的抗體特異性的吸附，用水或緩沖液將免疫親和柱上的雜質除去，然后用甲醇使抗體變性，從而將黃曲霉毒素從親和柱上洗脫下來。最后，用HPLC或熒光計進行定量檢測。
儲存條件
該親和柱保存在2-8 °C條件下，絕對不能冷凍，保質期為18個月。建議在室溫（18-30°C）下使用。
實驗溶液制備
1) 提取液，甲醇/水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水，混合均勻。
2) 提取液，乙腈/水（9+1）：取90mL乙腈加10mL水，混合均勻。
3) HPLC流動相，甲醇-乙腈-水（20+18+62，v/v）：取200mL甲醇、180mL乙腈、620mL水，混合均勻，用0.22微米的尼龍篩過濾。
4) 標準溶液的配制：取黃曲霉毒素混標（46304-U，B1和G1為1.0ug/mL,B2和G2為0.3ug/mL），甲醇為稀釋液，配制標準品溶液。例如：取100uL標準品原液于10mL容量瓶中，用甲醇定容至10mL，那么，黃曲霉毒素B1和G1為10ng/mL，黃曲霉毒素B2和G2為3ng/mL.
注：配制好的標準品溶液2-8℃冷藏保存有效期為24h。
5) 淋洗緩沖液，pH 7.0 PBS溶液：稱取8.0g氯化鈉，1.2g磷酸氫二鈉，0.2g磷酸二氫鉀，0.2g氯化鉀，用990mL純水溶解，然后用濃鹽酸調節(jié)pH值至7.0，最后用純水稀釋至1000mL。
或 量取100mL 10X Clover淋洗緩沖液（貨號：C3007）用900mL純水稀釋，混勻。
6) 0.5%的吐溫/PBS：將5.0mL吐溫-20加入到1L pH 7.0 PBS溶液中，混勻。
或 量取100mL 10X 0.5%的吐溫-20/pH7.0 PBS（貨號：C3008）用900mL純水稀釋，混勻。
液相色譜條件
色譜柱：Cloversil-C18 4.6*150mm（5um）或4.6*250mm（5um）
流動相：甲醇-乙腈-水（20+18+62，v/v）
流速：0.8mL/min
檢測器：熒光檢測器，激發(fā)波長360nm,發(fā)射波長450nm
進樣體積：20~100uL
光化學衍生化系統(tǒng)：光化學衍生器（254nm）
分析步驟
1 2020版-2351真菌毒素測定法-黃曲霉毒素測定法第一法和第二法：
1.1樣品提取及稀釋：
準確稱取試樣15.0g于均質杯中，加入3g氯化鈉，準確加入75.0mL甲醇-水（7+3），以均質器高速攪拌提取2min（攪拌速度大于11000r/min）。普通濾紙過濾或4000RPM離心5min，準確移取15.0mL濾液或上清液置于50mL容量瓶中，用純水稀釋至50mL, 混勻。用玻璃纖維濾紙過濾，至濾液澄清，量取20mL濾液備用；或 4000RPM離心10min，量取20ml上清液備用。
1.2樣品的凈化
將免疫親和柱連接于20.0mL玻璃注射器下。準確量取20mL處理好的樣品濾液或上清液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調節(jié)壓力使溶液以約3mL/min（1滴/秒）流速緩慢通過免疫親和柱，直至2~3mL空氣通過柱體。以3mL/min（1-2滴/秒）流速用10.0mL水淋洗柱子2次（必要時可以用淋洗緩沖液10mL淋洗，再用水10mL淋洗），棄去全部流出液，并使2mL~3mL空氣通過柱體。準確加入1.0mL色譜級甲醇洗脫，控制2mL/min（1滴/秒）流速，收集全部洗脫液，混勻，注入HPLC檢測。
2 中檢維康優(yōu)化方法：
1.1樣品提取及稀釋：
準確稱取試樣5.0g于50mL離心管中，加入1g氯化鈉，準確加入25.0mL乙腈-水（9+1），以均質器高速攪拌提取2min（攪拌速度大于11000r/min）。普通濾紙過濾或4000RPM離心5min，準確移取3.0mL濾液或上清液置于50mL離心管中，加入27mL0.5%的吐溫/PBS稀釋，混勻。用玻璃纖維濾紙過濾，至濾液澄清，量取20mL濾液備用。
1.2樣品的凈化
將免疫親和柱連接于20.0mL玻璃注射器下。準確量取20mL處理好的樣品濾液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調節(jié)壓力使溶液以約3mL/min（1滴/秒）流速緩慢通過免疫親和柱，直至2~3mL空氣通過柱體。以3mL/min（1-2滴/秒）流速用10.0mL水淋洗柱子，棄去全部流出液，并使2mL~3mL空氣通過柱體。準確加入2.0mL色譜級甲醇洗脫（注：可以用1ml甲醇洗脫，提高方法檢測靈敏度），控制2mL/min（1滴/秒）流速，收集全部洗脫液，混勻，注入HPLC檢測。
注意事項
1) 樣品添加回收試驗時，標準品添加到樣品中，靜置2小時后或過夜，再進行樣品前處理，否則會出現(xiàn)回收率偏低的現(xiàn)象。
2) 不要隨便更改操作說明書中的操作步驟，如需更改要和本公司技術部聯(lián)系，確認更改是否合理。
3) 操作步驟中，樣品過柱，淋洗，洗脫時，一定要控制好流速，不能太快，否則會使檢測結果偏低。
4) 如果將標準品直接過柱驗證回收率時，一定要確保標準上柱液中甲醇濃度不要超過25%，乙腈濃度不要超過20%，否則會影響柱子的吸附能力。
5) 試驗中使用的玻璃儀器等，一定要清洗干凈，尤其是用次氯酸等處理過的儀器，否則會使檢測結果偏低。
需要準備的設備及試劑（中檢維康提供）
| C/N編號 | 物品 |
| PHRED | 美國奧拉AURA光化學衍生器 |
| UVD | 科樂福CLOVER光化學衍生器 |
| 21022 | 科樂福CLOVER六位泵流操作架（配有1臺空氣泵，6個10mL針筒） |
| 20202 | 高速勻質器，轉速可達18,000 r/min ~22,000 r/min |
| 31955-C | 美國CLOVER微纖維濾紙（1.5um，100張/盒） |
| 31240-C | 折疊式槽紋濾紙（100張/盒），或中速定性濾紙 |
| 36010-C | 一次性塑料燒杯(25/包) |
| 34000-C | 一次性測試管(250支/包) |
| 36020-C | 塑料漏斗(10 個/包) |
| 46304-U | 黃曲霉毒素混合標準品1.0mL （B1和G1為1.0ug/mL,B2和G2為0.3ug/mL） |
| 35016 | 色譜純級的甲醇（4升/瓶） |
| C546150-U | 科樂福Cloversil C18 反相色譜柱4.6*150mm（5um） |
| C546250-U | 科樂福Cloversil C18 反相色譜柱4.6*250mm（5um） |
| 玉米、飼料等基質含有不同水平黃曲霉毒素的質控樣品 | |
| C3007-250 | 10X Clover淋洗緩沖液 |
| C3008-250 | 10X 0.5%的吐溫-20/pH7.0 PBS溶液 |
