Transwell技術自誕生以來，在研究細胞共培養(yǎng)、趨化性、遷移、侵襲實驗中都發(fā)揮了重要的作用，但是隨著科技的進步和發(fā)展，科研工作者們對Transwell實驗提出了更高要求，對小室中的微量細胞因子和細胞間信號聯(lián)系的研究也越來越多。為了解決精準調控和監(jiān)管培養(yǎng)液中不同因子的含量以及變化的需求，全新升級的Microfluidics-Transwell系統(tǒng)應運而生，它是建立在傳統(tǒng)Transwell系統(tǒng)上的細胞培養(yǎng)升級系統(tǒng)：Transwell系統(tǒng)搭配微流控技術，可以模擬體內在流體環(huán)境下的細胞生長情況，最大程度再現(xiàn)某種體內流體環(huán)境，以保證細胞生長和細胞間聯(lián)系的“本真”狀態(tài)，達到不同的實驗目的。

本期推送為大家?guī)�來一篇采用Microfluidics-Transwell培養(yǎng)3D人腸道上皮細胞的研究論文，一起來看看吧。

文章信息 .

文章題目：3D in vitro morphogenesis of human intestinal epithelium in a gut-on-a-chip or a hybrid chipwith a cell culture insert.

期刊：Natrue Protocols

影響因子：13.491

發(fā)表日期：2022年2月2日

DOI：10.1038/s41596-021-00674-3

【研究概述】

文章介紹了兩款仿生腸道芯片：Gut-on-a-chip腸道芯片和Transwell-insertable chip混合芯片，可以誘導自發(fā)的腸道上皮3D形態(tài)發(fā)生，具有良好的生理功能和生物力學特征。這種仿生腸道芯片結合了微流控技術，可以誘導Caco-2或腸道類器官上皮細胞發(fā)生，通過控制基底外側液體流動實現(xiàn)功能性腸道微結構的再生。其中，Transwell-insertable chip混合芯片構造更簡單，使用方便，可插入的Transwell可以獨立培養(yǎng)腸道上皮細胞，該芯片搭配微流控系統(tǒng)可以為體外形態(tài)發(fā)生提供生理學相關的剪切應力和機械運動，不需要復雜的細胞工程或操作，體現(xiàn)出比其他現(xiàn)有技術更多的優(yōu)勢。Transwell-insertable chip混合芯片提供了一種體外3D腸上皮細胞再生方法，對生物醫(yī)學研究界將產生廣泛影響，可應用于生物醫(yī)學、臨床醫(yī)學和藥物毒性和藥理學等研究領域。

Transwell-insertable chip混合芯片結構：

圖1. Transwell-insertable chip混合芯片結構示意圖

Transwell-insertable chip混合芯片的結構如圖1所示，由Transwell插件、微通道層和玻璃片組成，其中微通道分別由流入口和流出口與微流控系統(tǒng)連接。將獨立制備的用于培養(yǎng)單層腸上皮細胞的Transwell插件插入混合芯片中，培養(yǎng)基通過建立在Transwell插入物上的細胞層下面的微通道灌注，以誘導腸三維形態(tài)發(fā)生。

研究中混合芯片的實驗方案步驟可簡單總結為以下五步：

🔹 Transwell-insertable chip混合芯片的制備；

🔹 腸上皮細胞(Caco-2細胞或人腸類器官)的制備；

🔹 混合芯片上培養(yǎng)腸道上皮細胞；

🔹 體外三維形態(tài)發(fā)生的誘導；

🔹 三維上皮微結構的表征。

Transwell-insertable chip混合芯片腸上皮細胞3D培養(yǎng)特征：

圖2. Transwell-insertable chip混合芯片中腸上皮細胞形態(tài)發(fā)生特征圖

如圖2 Transwell-insertable chip混合芯片中腸上皮細胞形態(tài)發(fā)生特征所示，混合芯片中誘導腸道形態(tài)發(fā)生的流程：

1）將分離的上皮細胞放入準備好的Transwell插件中；

2）細胞被播種并附著在Transwell插件的聚酯膜上，所有細胞都在靜態(tài)條件下培養(yǎng)(TW培養(yǎng))；

3）7天后，將含有單層上皮細胞的單個Transwell插入物整合到混合芯片中并接入基底外側流動(flow, BL)；

4）最終生成三維上皮細胞層(Morphogenesis)。

圖b所示混合芯片(左圖)誘導腸上皮細胞的類器官三維形態(tài)發(fā)生，在不同的z軸位置(上、中、下；見右側示意圖對應的虛線)顯示出明顯的形態(tài)特征。其中青色為肌動蛋白，灰色為細胞核。圖c為腸上皮細胞在靜態(tài)Transwell中培養(yǎng)(TW;左上角小圖)和在混合芯片中誘導培養(yǎng)后（Hybrid Chip；下方大圖）的熒光共聚焦顯微圖，可以清晰觀察到混合芯片中產生了三維形態(tài)；XZ視角橫切視圖(右上角小圖)也顯示混合芯片培養(yǎng)的腸上皮細胞發(fā)生了三維形態(tài)的改變，而靜態(tài)Transwell中培養(yǎng)得腸上皮細胞未見形態(tài)變化。

Transwell-insertable chip混合芯片優(yōu)勢分析：

1. 研究中提及外源性添加Wnt拮抗劑到芯片上會抑制三維形態(tài)發(fā)生或破壞預結構的三維上皮層，提示了在三維培養(yǎng)過程中的拮抗力與體外腸道形態(tài)發(fā)生有關。因此，利用微流控系統(tǒng)通過主動清洗或擴散基底外側培養(yǎng)液中的形態(tài)拮抗劑，可以促進腸上皮細胞三維形態(tài)形成。

2. 混合芯片優(yōu)于體內動物模型以及其他傳統(tǒng)的靜態(tài)二維細胞培養(yǎng)模型。動物研究對勞動力和成本要求高且存在動物倫理問題。最重要的是，遺傳背景差異使得動物模型不能準確地替代模擬人的組織器官的發(fā)生和生理代謝等過程。混合芯片的細胞可以是病人組織樣本來源，盡可能消除物種間差異。此外，混合芯片是微流控3D培養(yǎng)，相比傳統(tǒng)靜態(tài)二維培養(yǎng)更加真實地模擬體內動態(tài)變化的生理環(huán)境對細胞的影響

3. 混合芯片中提供了自發(fā)的腸道形態(tài)發(fā)生和生理相關的剪切應力，可以模擬腸道蠕動的生物力學，以及獨立并可反復操作的Transwell可插入式頂室和基底外側室。相比較與腸道干細胞培養(yǎng)得到的封閉腸道類器官，混合芯片可以方便快捷地引入微生物細胞或外源抗原，進行轉運分析或宿主-微生物組共培養(yǎng)；相比于傳統(tǒng)的水凝膠支架類器官，混合芯片可在微流控系統(tǒng)的控制下為整個微環(huán)境提供動態(tài)的腔內或間質流動，和生理功能所需的流體剪切應力，準確反映活躍的體內生物力學。同時，傳統(tǒng)的類器官預構造的三維水凝膠支架可能會阻礙腸上皮細胞的自發(fā)形態(tài)發(fā)生過程。

Transwell-insertable chip混合芯片應用前景分析：

1. 為基礎醫(yī)學、藥學等基礎研究領域提供新的工具和手段�；旌闲酒�具有可重復性和系統(tǒng)穩(wěn)定性，可以研究腸道發(fā)育、再生或穩(wěn)態(tài)過程中細胞信號動力學；可以研究諾如病毒、嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)、艱難梭狀芽胞桿菌、鼠傷寒沙門氏菌或霍亂弧菌等各種感染性病原體下的疾病病理和發(fā)病機制；允許縱向共培養(yǎng)，以及隨后評估宿主防御、免疫反應和胃腸道(GI)中病原體相關的損傷修復；使用患者的活檢或干細胞來源的腸類器官制備三維腸上皮層時，可以模擬腎炎或腸易激綜合征；可以考慮在包含三維腸絨毛-隱窩微結構中添加與疾病相關的其他細胞類型，以更好地模擬疾病環(huán)境的復雜性。

2. 混合芯片具有可組裝的Transwell室，易于拆卸和操作�？梢栽跊]有切片過程的情況下固定和可視化，進行轉錄組學研究和高分辨率或超分辨率成像，以繪制三維上皮微環(huán)境中基因和蛋白質對微生物或免疫刺激的時空動態(tài)響應；同時經過設計改造后可配合24、96或384孔板，加上微流控系統(tǒng)可以連續(xù)補充基底外側區(qū)室，適合在制藥、生物醫(yī)學或食品工業(yè)中開發(fā)高通量篩選或驗證平臺。

【總結】

全新升級的Microfluidics-Transwell系統(tǒng)在以下幾個方面盡顯優(yōu)勢：

☑ 可以精確控制下室培養(yǎng)液的種類、因子含量以及給液速度，盡可能模擬體內細胞外基質和流體環(huán)境，滿足多種實驗需求；

☑ 可以精確定量下室培養(yǎng)液成分變化，檢測上下層培養(yǎng)細胞分泌的細胞信號物質，更準確地研究細胞間聯(lián)系；

☑ 可以再現(xiàn)流體環(huán)境并且更加真實地模擬腫瘤細胞轉移過程（腫瘤細胞內滲、進入循環(huán)系統(tǒng)、腫瘤細胞外滲、形成轉移灶等）。

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