類生物膜具有與細(xì)胞膜高度的相似性,因此具有極高的生物安全性和藥物遞送潛能,本文將銜接上文,從不同來源的細(xì)胞膜的角度出發(fā)簡單列舉類生物膜膜載藥遞送體系在抗腫瘤領(lǐng)域中的應(yīng)用｡

1. 紅細(xì)胞膜包被的納米顆粒遞藥體系

紅細(xì)胞在體內(nèi)主要負(fù)責(zé)輸運(yùn)氧氣,在人體血液系統(tǒng)中的壽命可達(dá) 120 天｡這種能夠長時(shí)間循環(huán)在血液系統(tǒng)中的特性也是納米遞藥體系非常需要的一個(gè)理想功能,主要是由紅細(xì)胞表面的 CD47 分子和一系列補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白在內(nèi)的標(biāo)志物介導(dǎo)的｡下圖 展示的最初的研究示意圖,將體外獲得紅細(xì)胞經(jīng)低滲處理離心后得到紅細(xì)胞膜碎片,然后將其經(jīng)超聲和機(jī)械擠壓等過程得到紅細(xì)胞膜衍生的囊泡,將其與由聚乳酸(PLGA)制成的聚合物內(nèi)核一起共擠出得到紅細(xì)胞包裹的PLGA 納米顆粒｡利用生物透射電鏡(TEM)和動態(tài)光散儀(DLS)表征方法進(jìn)行了表征后均表明紅細(xì)胞膜包裹在了納米顆粒的表面｡值得注意的是將此種仿生納米顆粒靜脈注射到小鼠體內(nèi)時(shí),納米顆粒能夠在血液系統(tǒng)循環(huán)更長的時(shí)間,清除半衰期達(dá)到 40 小時(shí),遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于 PEG 修飾效率｡這種長循環(huán)特性得益于天然紅細(xì)胞膜,這種循環(huán)特性可以幫助納米體系在抗腫瘤治療過程中增強(qiáng) EPR 效應(yīng),發(fā)揮其應(yīng)用潛力｡

圖 1 紅細(xì)胞膜修飾包被的納米顆粒｡

利用低滲處理的方法從紅細(xì)胞中提取細(xì)胞膜,通過與聚合物的納米顆粒物內(nèi)核一起共擠出得到紅細(xì)胞膜包被修飾的納米顆粒｡紅細(xì)胞膜仿生納米顆粒保留了很多與原始紅細(xì)胞膜同樣的表面標(biāo)志物,如 CD47 作為紅細(xì)胞膜的標(biāo)志性分子標(biāo)記物能夠幫助免疫逃避和延長血液循環(huán)｡

2. 白細(xì)胞膜包被的納米顆粒遞藥體系

白細(xì)胞是血液循環(huán)中除紅細(xì)胞之外的又一細(xì)胞主體成分,包括多種炎癥細(xì)胞,有中性粒細(xì)胞,樹突狀細(xì)胞,巨噬細(xì)胞,嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞,以及淋巴細(xì)胞等｡白細(xì)胞廣泛存在于血管和淋巴管以及其他組織中,大多數(shù)白細(xì)胞可以做變形運(yùn)動,這使得他們極易在血管和淋巴管之間遷移｡慢性炎癥已被定義為腫瘤的主要特征之一,腫瘤細(xì)胞通過各種吸引白細(xì)胞的細(xì)胞因子和趨化因子來招募各種白細(xì)胞為自己所用,使之成為被腫瘤細(xì)胞同化的各種腫瘤相關(guān)細(xì)胞｡其中之一的腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞因其因其炎癥趨化性而成為腫瘤靶向的有希望的藥物遞送載體｡下圖是用巨噬細(xì)胞膜包被的金納米顆粒用于腫瘤的光熱治療示意圖,只要是利用金顆粒的近紅外特性和巨噬細(xì)胞膜表面分子 CD45､CD11a 和多糖分子所介導(dǎo)的免受吞噬細(xì)胞吞噬的作用及靶向腫瘤灶高炎癥的特性,在743nm 的激光照射下產(chǎn)生熱療效應(yīng),用于消融腫瘤｡

圖 2.  用巨噬細(xì)胞膜包被金納米顆粒用于腫瘤的光熱治療｡

a) 巨噬細(xì)胞作為膜囊泡的來源,用來在金納米顆粒形成涂層｡b)巨噬細(xì)胞膜的包被可以保護(hù)金納米球殼免受巨噬細(xì)胞的攝取和幫助增強(qiáng)腫瘤富集,金納米顆粒核芯能夠在激光照射下產(chǎn)生熱療作用用于腫瘤消融｡

3. 腫瘤細(xì)胞膜包被的納米顆粒遞藥體系

近年來也有科學(xué)家用腫瘤細(xì)胞膜來作為仿生膜包裹納米顆粒,腫瘤細(xì)胞膜所能提供的作用主要有兩方面,一是他們擁有靶向腫瘤灶的同源靶向能力;二是腫瘤細(xì)胞膜表面攜帶有很多腫瘤相關(guān)抗原,這種由體外處理后的腫瘤細(xì)胞膜包被的納米體系能夠?qū)⒛[瘤抗原運(yùn)輸?shù)侥[瘤部位,以刺激天然免疫反應(yīng)的發(fā)生,進(jìn)而來殺傷腫瘤細(xì)胞,腫瘤細(xì)胞膜的這種作用首次在利用黑色素瘤細(xì)胞膜包裹 PLGA納米顆粒的應(yīng)用上得到證實(shí)｡圖3 展示的是將攜帶有腫瘤相關(guān)抗原和同型連接抗原的腫瘤細(xì)胞膜包被在聚合物納米顆粒內(nèi)核上用于腫瘤抗原的遞送和腫瘤的同源靶向｡類似的工作也有科學(xué)工作者利用幾種不同腫瘤細(xì)胞膜與不同的免疫佐劑整合在一起用來包裹納米顆粒用于增強(qiáng)腫瘤免疫治療效果｡

圖 3.  腫瘤細(xì)胞膜包被納米顆粒用于癌癥疫苗的遞送和同源靶向｡

用腫瘤細(xì)胞膜包被的聚合物納米顆粒能夠遞送大量的腫瘤抗原給免疫細(xì)胞,用于殺傷腫瘤的免疫細(xì)胞的加工和處理,癌癥細(xì)胞膜表面含有同型粘附分子,在經(jīng)過包被后,這些粘附分子能保留在納米顆粒表面用于藥物的腫瘤靶向遞送｡

4. 細(xì)菌外泌體囊泡包被的納米顆粒遞藥體系

雖然細(xì)胞膜包被技術(shù)幾乎都是以哺乳動物細(xì)胞作為仿生膜的來源,但也有利用原核細(xì)胞生物的細(xì)胞膜作抗腫瘤的相關(guān)研究｡如各種革蘭式陽性細(xì)菌在生長過程中會產(chǎn)生大量細(xì)菌外膜囊泡(OMV),其內(nèi)部含有對細(xì)菌生存至關(guān)重要的影響因子,另外由于這些 OMV 表明含有多種細(xì)菌抗原如脂多糖 LPS,已被用于各種腫瘤疫苗的研究｡應(yīng)用 OMV 作為腫瘤疫苗研究的優(yōu)勢在于可以采用膜擠出､超聲等方法,將細(xì)菌外囊泡制成粒徑在 30~50nm 大小的尺寸,這是經(jīng)皮下注射進(jìn)行淋巴運(yùn)輸?shù)睦硐氤叽?#65377;下圖展示的就是利用細(xì)菌產(chǎn)生的外膜囊泡來包裹包被金納米顆粒以促進(jìn)機(jī)體抗菌免疫效應(yīng)的增強(qiáng),當(dāng)將其作為疫苗接種于小鼠后,通過對引流淋巴結(jié)的分析顯示,抗原呈遞的樹突狀細(xì)胞數(shù)量增加而且成熟水平更高,進(jìn)而誘導(dǎo)活化的效應(yīng) T 細(xì)胞數(shù)量增加,使得免疫因子 IFN-γ 和 IL-17 水平也顯著增強(qiáng),這對調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫都是十分重要的,而且在進(jìn)行腫瘤細(xì)胞殺傷過程中也發(fā)揮重要作用｡

圖 4. 細(xì)菌膜包被的納米顆粒用于調(diào)控抗菌免疫｡

細(xì)菌分泌的外膜囊泡含有大量的細(xì)菌表面抗原,將其用于包被包裹金納米顆粒能有效促進(jìn)樹突狀細(xì)胞對抗原的內(nèi)在化｡在注射疫苗后,仿生金納米顆粒能夠誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞的成熟,產(chǎn)生高的抗菌效價(jià).

5. 雜合膜包被的納米顆遞藥體系

到目前為止所討論的許多細(xì)胞類型突出了利用細(xì)胞膜涂層技術(shù)可以賦予納米載體獨(dú)特的功能特性,有時(shí),將多種細(xì)胞類型的功能合并到一個(gè)納米顆粒上也是可取的,即將兩種不同的生物膜整合在一起用來包裹納米顆粒實(shí)現(xiàn)功能最大化｡這一想法在紅細(xì)胞與血小板的雜合膜用以提高功能的概念驗(yàn)證性工作中得到證明,如下圖所示｡雜合膜是由兩種純化的生物膜在 37°C 環(huán)境中溫柔攪拌制備而成,為了證明雜合膜的存在,在血小板膜上摻雜福斯特共振能量轉(zhuǎn)移對,一旦兩膜共孵育后,熒光恢復(fù)能夠被觀察到,說明雜合膜的成功產(chǎn)生;分別用不同的熒光基團(tuán)標(biāo)記的血小板膜和紅細(xì)胞膜制備而成的雜合膜來包裹修飾由 PLGA制成的納米顆粒內(nèi)核,通過在熒光顯微鏡下觀察載體表面的共定位情況來驗(yàn)證融合的雜合膜的存在｡至于他們的理化性質(zhì),這種紅細(xì)胞和血小板的雜合膜與單獨(dú)一種膜包裹修飾的納米顆粒的性質(zhì)相同,而且也展示了特征性的核-殼結(jié)構(gòu)｡這種的雜合膜的制備可以分別將兩種不同的生物膜的功能整合在一起,賦予納米顆粒更多的表面功能特性｡

圖 5. 紅細(xì)胞與血小板的混合膜包被包被納米顆粒用于提高納米顆粒的功能｡

這種用兩種生物膜整合的雜合膜用于包裹納米顆粒的方式可以保留兩種細(xì)胞膜的特異性功能｡

類似的雜合膜技術(shù)還有利用腫瘤細(xì)胞膜和白細(xì)胞膜構(gòu)建的白質(zhì)體 Leutusome,這里是利用脂質(zhì)體作為構(gòu)建模塊,與兩種細(xì)胞膜融合,并在其中包裹疏水性化療藥紫杉醇 PTX 制成脂質(zhì)體納米粒,如下圖｡通過對兩種細(xì)胞膜的質(zhì)膜成分進(jìn)行體外檢測和驗(yàn)證,采用頭頸部腫瘤異種移植小鼠模型,研究不同脂質(zhì)體納米粒的血液清除動力學(xué)､生物分布和抗腫瘤效果｡結(jié)果表明,白質(zhì)體 Leutusome 具有較長的血液循環(huán),且在腫瘤部位最有效地積累｡總的來說,隨著細(xì)胞類型的廣泛可用,當(dāng)需要一組以上的細(xì)胞特定功能時(shí),這種混合膜涂層策略有可能是有用的,需要在應(yīng)用的基礎(chǔ)上仔細(xì)考慮每種膜的相對含量｡

圖 6. 白細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞膜的復(fù)合膜形成的偽裝脂質(zhì)體作為紫杉醇的包裹載體和在腫瘤治療和診斷中的應(yīng)用的示意圖展示

各種各樣的生物膜被開發(fā)應(yīng)用修飾各種有機(jī)和無機(jī)納米載體表面,這樣制成的仿生納米載體被用來治療各種疾病,近年來也有科學(xué)家將多種不同功能的生物膜整合在一起修飾納米顆粒得到具有多種靶向功能的仿生載體｡但是關(guān)于仿生膜在靶點(diǎn)位置的藥物釋放問題很少有相關(guān)研究,即賦予仿生膜一些刺激響應(yīng)功能幫助仿生載體更有效的實(shí)現(xiàn)藥物釋放,這對于提高疾病治療效率是十分重要的性質(zhì),也是仿生膜納米載體功能化及實(shí)現(xiàn)智能響應(yīng)仿生納米載體的未來發(fā)展方向｡

6. 血小板膜在仿生納米藥物抗腫瘤中的重要作用

血小板是由機(jī)體骨髓中成熟的巨核細(xì)胞胞質(zhì)脫落下來的細(xì)胞碎片,在血液循環(huán)系統(tǒng)中主要起到止血和凝血,支持營養(yǎng)和修復(fù)血管內(nèi)皮的作用,除此之外血小板在調(diào)控機(jī)體的宿主免疫和炎癥反應(yīng)過程中也發(fā)揮重要作用｡現(xiàn)在有大量的實(shí)驗(yàn)和臨床數(shù)據(jù)表明血小板在腫瘤發(fā)生､發(fā)展､侵襲和轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用,這主要是源于腫瘤細(xì)胞與血小板的相互作用,如下圖所示｡首先腫瘤細(xì)胞在穿過血管內(nèi)皮進(jìn)入血管后能夠刺激活化血小板,進(jìn)而介導(dǎo)粘附作用,例如肺癌細(xì)胞可以高表達(dá) P 選擇素糖蛋白適配體 1(PSGL-1),這是一種在白細(xì)胞表面常見的蛋白,它與活化的血小板表面的 P 選擇素具有高度親和力;某些腫瘤細(xì)胞通過表達(dá)一種平足蛋白與血小板表面 C 型凝集素樣受體-2(CLEC-2)相互作用,誘導(dǎo)血小板活化與聚集｡受到刺激活化的血小板可以跟腫瘤細(xì)胞直接接觸,形成一個(gè)聚集體幫助腫瘤細(xì)胞在血液循環(huán)中免受自然殺傷細(xì)胞的監(jiān)視和殺傷,血小板除了直接與腫瘤細(xì)胞發(fā)生物理作用外,還通過分泌多種生物因子如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)､多巴胺､血清素和內(nèi)皮抑素等調(diào)控腫瘤血管生成,從而支持腫瘤的進(jìn)展｡此外活化的血小板還可通過其內(nèi)部的 α 顆粒釋放轉(zhuǎn)化生長因子 β1(TGFβ1)來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,這是腫瘤細(xì)胞入侵和轉(zhuǎn)移非常重要的一步｡雖然到目前為止,大多數(shù)研究都集中在血小板在癌癥轉(zhuǎn)移和血管生成中的作用上,但最近的數(shù)據(jù)表明,血小板在腫瘤發(fā)展中的作用正在擴(kuò)大,尤其是其對化療耐藥性和癌癥生長的潛在貢獻(xiàn),這主要是由血小板釋放的溶血磷脂酶(LPA)和血小板因子 4(PF4)介導(dǎo),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長,另外也有新的研究表明血小板在腫瘤免疫抑制環(huán)境中發(fā)揮一定作用｡

圖7.  體內(nèi)血小板產(chǎn)生的原理圖｡

腫瘤細(xì)胞通過旁分泌產(chǎn)生的白介素-6(IL-6)能夠刺激肝臟產(chǎn)生血小板生成素,反過來,這些因子可以促進(jìn)巨核細(xì)胞和血小板的產(chǎn)生｡這些事件的聯(lián)合可以促進(jìn)癌癥患者體內(nèi)的血小板增多和高凝狀態(tài)的形成｡

鑒于血小板在腫瘤環(huán)境中的各種生理和病理的重要作用,越來越多的科學(xué)家嘗試將血小板膜包被修飾在納米顆粒表面,從而賦予納米載體各種天然血小板所具有的功能,如延長納米顆粒的血液循環(huán)時(shí)間､增強(qiáng)其生物相容性､提高納米顆粒在腫瘤部位的主動靶向能力等｡顧臻等團(tuán)隊(duì)就利用血小板膜表面高表達(dá)的 P選擇素和乳腺癌細(xì)胞表面的 CD44 受體的相互作用來賦予仿生載體主動靶向特性如圖8 所示,仿生體系的內(nèi)核是由單次乳化法得到的包載化療藥阿霉素(DOX)的納米顆粒,再用超聲擠出的方法將血小板膜包裹在外層,然后在膜上嵌入一種腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體(TRAIL)｡以期能夠?qū)崿F(xiàn)在血小板膜介導(dǎo)的靶向作用下,通過 TRAIL 與腫瘤細(xì)胞表面的凋亡受體結(jié)合,啟動凋亡信號途徑,同時(shí)增強(qiáng)阿霉素在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的急劇積聚,達(dá)到增強(qiáng)殺傷作用｡

圖 8. 載藥的血小板膜囊泡(PM-NV)用于靶向和藥物遞送的原理示意圖｡

a)  藥物載體TRAIL-Dox-PM-NV 的主要成分:TRAIL 連接在血小板衍生的膜上;Dox-NV｡b)體內(nèi) CTCs的清除和 TRAIL 和 Dox 的遞送｡載體可以通過血小板膜表面的 P-選擇素和腫瘤細(xì)胞的表面CD44 受體的特異性粘附,隨后觸發(fā)的 TRAIL 和 Dox 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號通路｡ⅰ)TRAIL和腫瘤細(xì)胞表面的死亡受體 DRs 受體的相互作用觸發(fā)凋亡信號;ⅱ)載體的內(nèi)吞;ⅲ)由溶酶體的酸性介導(dǎo)的 TRAIL-Dox-PM-NV 的解離;ⅳ)Dox 的釋放和在核內(nèi)的聚集;ⅴ)Dox 觸發(fā)細(xì)胞的凋亡。