定量聚合酶鏈反應（qPCR）分析具有高靈敏度，這是其成功并廣泛應用于科學實驗室的最重要原因之一。然而，包括移液技術在內的許多因素都會對qPCR分析的結果產生影響。在進行基于PCR原理的分析實驗時，對于Master Mix的移液需重點關注良好的移液技術及耗材的正確選擇，從而獲得可重現(xiàn)且可靠的結果。

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《如何移液PCR Master Mix以提高qPCR結果的準確性》應用說明中使用賽多利斯 Tacta® 手動移液器和Picus® 電動移液器進行了測試，證明使用低吸附移液器吸頭搭配正向移液技術或使用標準移液器吸頭搭配反向移液技術對Master Mix進行移液可獲得良好的精準度和準確度，使用電動移液器確保了移液速度及結果的重現(xiàn)性。
引言
基于PCR原理的應用已成為生物制藥工藝、臨床診斷和學術研究的關鍵手段。然而，在執(zhí)行定量聚合酶鏈反應（qPCR）時，分析結果的可變性可能是個問題。

在qPCR準備階段，對Master Mix試劑進行移液具有挑戰(zhàn)性。Master Mix通常由聚合酶、dNTP、MgCl2以及可能含有吐溫和甘油成分的緩沖液組成。由于Master Mix必須在冰上存放，所以液體有點粘稠和冰冷，這些特性使得移取正確體積的Master Mix變得困難。

根據(jù)ISO-8655，應在移液前對移液器吸頭進行預潤洗，尤其是移取粘性液體時。對于粘性液體，預潤洗的作用類似于反向移液技術中吸入的額外樣品體積，并對因粘性液體在移液過程中粘附在標準塑料移液器吸頭上而導致的樣品損失進行補償。目前，研究人員可以選擇使用低吸附移液器吸頭，當移取粘性液體時可大大減少滯留在移液器吸頭上的殘留樣品量。

在本應用說明中，我們對Master Mix的移取進行了以下測試：

• 正向移液與反向移液
• 移液器吸頭類型
• 預潤洗
• 使用電動移液器的優(yōu)勢

方法

移液技術
移液器是一種精密儀器，它與吸頭組合為一個系統(tǒng)來發(fā)揮作用。為避免因移液不當而導致數(shù)據(jù)變化，在整個實驗過程中應堅持使用正確的移液技術，即在移液器上使用同廠家（賽多利斯）的吸頭，以確保移液器和移液器吸頭之間的恰當密封。在吸液過程中保持移液器垂直。吸液過程中，將吸頭浸入Master Mix中的深度保持在2mm，以避免吸入體積過多，并避免過多的Master Mix粘附在移液器吸頭外側。在排液過程中，移液器呈45度角，移液器吸頭接觸PCR管的內側。正向移液和反向移液技術如圖1所示。
 
qPCR準備
qPCR準備階段使用賽多利斯移液器（Tacta® 手動移液器和Picus® Nxt 電動移液器）、賽多利斯SafetySpace濾芯吸頭及低吸附濾芯吸頭。使用Maxima SYBR Green qPCR Master Mix（不含ROX）、大腸桿菌uidA基因引物以及無核酸酶水來制備用于所有測試的PCR Master Mix儲備液。用移液器重復將八個15μL的Master Mix移取至PCR板孔中，用于各種測試條件。

無模板對照（NTC）樣品不含大腸桿菌基因組DNA，并加入了5μL無核酸酶水。用類似方法移取含有5μL大腸桿菌gDNA的系列稀釋標準品（含有1×106，1×105，1×104，1×103 以及1×102個拷貝|反應）。在每個測試孔中加入5μL含有1×103個拷貝/反應的大腸桿菌gDNA。使用Picus® Nxt 電動移液器的多次分液功能配合低吸附濾芯吸頭，以相同的方式將所有DNA樣本添加到PCR管中。使用LightCycler® 480 qPCR儀進行qPCR分析。循環(huán)參數(shù)如下：在95℃下預培養(yǎng)10分鐘，隨后在95℃ 10秒、55℃ 10秒、75℃ 15秒，三步循環(huán)40次，最后在75℃下延伸10秒。對標準品、對照品和樣品中的SYBR綠色熒光激發(fā)進行定量。使用LightCycler® 480軟件確定定量循環(huán)定量循環(huán)（Cq）值和實際拷貝數(shù)，并使用MS Excel分析結果。

數(shù)據(jù)分析
移液過程中的系統(tǒng)誤差是準確度的一種度量——它反映了所得結果與真實值的接近程度。Cq值的百分比系統(tǒng)誤差（%S）反映了處理Master Mix的儀器系統(tǒng)（移液器和吸頭系統(tǒng)）Cq值的誤差。移液過程中的隨機誤差是結果精確度的一種度量，反映了實驗中重復樣品之間的差異。Cq值的百分比隨機誤差（%R）反映了結果的重現(xiàn)性，并且可能受到實驗人員移液操作的影響。百分比不確定度的數(shù)值同時說明了結果的準確度（百分比系統(tǒng)誤差）和精確度（百分比隨機誤差）。


結果

正向移液和反向移液
使用Tacta®手動移液器、標準SafetySpace濾芯吸頭和低吸附濾芯吸頭，對使用正向移液與反向移液移取Master Mix進行比較，并將正向移液預潤洗與反向移液前的預潤洗與否的結果進行比較。

如圖2所示，使用低吸附濾芯吸頭搭配正向移液技術獲得了最佳的結果（Cq的百分比系統(tǒng)誤差=0.02，Cq的百分比隨機誤差=0.46，Cq的百分比不確定度=0.9）。第二好的方法是使用標準濾芯吸頭搭配反向移液技術（Cq的百分比系統(tǒng)誤差=0.22，Cq的百分比隨機誤差=0.50，Cq的百分比不確定度=1.2）。 圖2：Master Mix正向和反向移液的Cq（定量循環(huán)）百分比誤差。顯示了Cq（定量循環(huán)）的百分比系統(tǒng)誤差和Cq的百分比隨機誤差。對于每個數(shù)據(jù)點，n=8。與反向移液相比，正向移液的系統(tǒng)誤差較低（灰色條）。標準吸頭為賽多利斯SafetySpace濾芯吸頭，低吸附吸頭為賽多利斯SafetySpace低吸附吸頭。

因此，使用低吸附移液器吸頭搭配正向移液技術或使用標準移液器吸頭搭配反向移液技術是準確且精確地移取Master Mix的良好方法。這一結果還表明，低吸附移液器吸頭的低吸附性能消除了反向移液技術或預潤洗技術中由于液體的粘稠性而需要額外的樣品去補償粘附在標準移液器吸頭上造成的損失。

移取Master Mix前對移液器吸頭進行預潤洗
預潤洗能夠調節(jié)空氣置換式移液器的空氣柱，并用額外的樣品在移液器吸頭的內側形成液體膜，以提高結果的重現(xiàn)性（精確度，百分比隨機誤差）。使用Tacta® 手動移液器和標準SafetySpace濾芯吸頭，在移取Master Mix之前對移液器吸頭預潤洗5次。如圖3所示，與ISO-8655一致，對于使用標準濾芯吸頭吸取Master Mix，與正向移液前不進行預潤洗（Cq的百分比隨機誤差=0.8）相比，正向移液前預潤洗吸頭略微改善了結果的重現(xiàn)性（Cq的百分比隨機誤差=0.7）。然而，與使用正向移液搭配預潤洗技術（Cq的百分比隨機誤差=0.7）相比，使用標準濾芯吸頭搭配反向移液技術具有更好的結果重現(xiàn)性（Cq的百分比隨機誤差=0.5）。與預期結果相同，與反向移液前不進行預潤洗（Cq的百分比隨機誤差=0.5）相比，反向移液前預潤洗對結果的重現(xiàn)性沒有顯著影響（Cq的百分比隨機誤差=0.5），因此反向移液前無需預潤洗標準濾芯吸頭。值得注意的是，與在正向移液前進行預潤洗（Cq的百分比隨機誤差=0.7）相比，使用低吸附濾芯吸頭搭配正向移液技術移取Master Mix具有更好的重現(xiàn)性（Cq的百分比隨機誤差=0.5）。
  圖3：（A）在移取Master Mix時，移液器吸頭預潤洗和不潤洗的Cq（定量循環(huán)）百分比誤差，顯示了Cq（定量循環(huán)）的百分比系統(tǒng)誤差和Cq的百分比隨機誤差。對于每個數(shù)據(jù)點，n=8。(B）量化的大腸桿菌uidA拷貝數(shù)。黃線表示實際目標數(shù)量。正向移液不潤洗的系統(tǒng)誤差比預潤洗更低。標準吸頭為賽多利斯SafetySpace濾芯吸頭

低吸附移液器吸頭及標準移液器吸頭
使用賽多利斯低吸附濾芯吸頭和SafetySpace濾芯吸頭搭配Tacta® 手動移液器對適用于移取Master Mix的移液器吸頭類型進行了測試。如圖4所示，使用正向移液技術時，與搭配標準濾芯吸頭（Cq百分比隨機誤差=0.8，Cq百分比系統(tǒng)誤差=-0.03，百分比不確定度=1.6）相比，搭配低吸附濾芯吸頭的重現(xiàn)性更好，且Cq值的不確定度更低（Cq百分比隨機誤差=0.5，Cq百分比系統(tǒng)誤差=0.02，百分比不確定度=0.9）。這一結果表明，低吸附吸頭最適合用于處理PCR Master Mix。
電動移液器
使用賽多利斯Picus® Nxt電動移液器、賽多利斯Tacta®手動移液器搭配低吸附濾芯吸頭，對移取Master Mix進行了對比測試。電動移液器使用了多次分液模式，手動移液器采用正向移液技術。如圖5所示，當使用低吸附濾芯吸頭移取Master Mix時，采用電動移液器的多次分液模式所得結果為：Cq=24.54±0.09，Cq的百分比系統(tǒng)誤差=0.12，Cq的百分比隨機誤差=0.4，Cq的百分比不確定度=0.9；相比之下，采用手動移液器的正向移液所得結果為：Cq=24.52±0.11，Cq的百分比系統(tǒng)誤差=0.02，Cq的百分比隨機誤差=0.5，Cq的百分比不確定度=0.9。使用電動移液器得到的結果具有良好的重現(xiàn)性（百分比隨機誤差），且其Cq值的總體百分比不確定度與手動移液器相當，都處于較低水平。電動移液器的多次分液模式可確保一次吸液，即可將Master Mix按順序分配到所有八個重復孔中，顯著提高了移液速度，并減少移液器吸頭的使用數(shù)量，更環(huán)保的同時也減少了不同吸頭之間的差異。
  圖5：（A）使用電動或手動移液器移取Master Mix時的誤差百分比。顯示了Cq的百分比隨機誤差和Cq的百分比不確定度（百分比隨機誤差和百分比系統(tǒng)誤差）。手動移液器采用正向移液技術，電動移液器采用多次分液模式。(B）量化的大腸桿菌uidA拷貝數(shù)。黃線表示實際目標數(shù)量。對于每個數(shù)據(jù)點，n=8。低吸附吸頭為賽多利斯SafetySpace低吸附吸頭。

討論

移液是PCR檢測的基礎。本研究證明了最佳技術搭配是使用正向移液技術搭配低吸附濾芯吸頭，而標準移液器吸頭移搭配反向移液技術可提供次佳的結果重現(xiàn)性（精密度）。還證明了電動移液器能夠確保較高的準確度和精密度，并加快完成分析的速度，減少移液所需的時間，使操作更符合人體工程學。因此，它可以降低實驗室工作人員患上重復性勞損（RSI）的可能性，并使實驗更不容易出錯；此外，它還能在相同的實驗中使用更少的移液器吸頭，因此也是更環(huán)保的選擇。

 

本研究結果特別適用于需要報告分析的CV%和Z因子，以便為最終用戶提供最佳規(guī)格的分析開發(fā)、診斷和質量控制人員。這些指南對于執(zhí)行定量分析的個人也很重要，例如確定腸道微生物群特征，其中細菌的定性和定量可通過qPCR分析進行，或在研發(fā)過程中測定細胞培養(yǎng)上清液和細胞培養(yǎng)基成分中的細菌污染，或用于合規(guī)性測試，例如根據(jù)EP/USP/JP 使用qPCR試劑盒進行測試，如賽多利斯Microsart® 研究細菌試劑盒。
 

Microsart®