肝細(xì)胞癌（HCC）是全球癌癥死亡的第三大原因。由于缺乏早期診斷標(biāo)志物，大多數(shù)HCC患者往往在確診時(shí)已處于晚期，預(yù)后較差。門(mén)靜脈系統(tǒng)的環(huán)境可能在HCC的發(fā)展中起重要作用。越來(lái)越多的證據(jù)表明，代謝物對(duì)HCC的形成很重要。然而，由于門(mén)靜脈血的可及性較差。因此，比較HCC患者與健康受試者在門(mén)靜脈、中央靜脈、肝組織和糞便樣本中的代謝變化，更有助于深入了解腸-肝軸進(jìn)而評(píng)估HCC患者的潛在病因和新的治療靶點(diǎn)。來(lái)自香港中文大學(xué)的于君團(tuán)隊(duì)等對(duì)HCC患者和健康肝臟供體的血清、肝臟和糞便樣本進(jìn)行綜合代謝組學(xué)分析，以揭示HCC患者以前未報(bào)道的代謝改變，相關(guān)研究成果發(fā)表于《Gut》。

 

 

1. HCC患者和健康對(duì)照的隊(duì)列設(shè)計(jì)及特征

招募兩個(gè)獨(dú)立的HCC患者和健康肝臟供體隊(duì)列，采用嚴(yán)格的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，以避免對(duì)菌群或菌群代謝物的影響。建立兩個(gè)研究隊(duì)列來(lái)探索代謝改變和HCC之間的關(guān)聯(lián)。其中，發(fā)現(xiàn)隊(duì)列包括52例HCC患者和50例健康對(duì)照，驗(yàn)證隊(duì)列包括50例HCC患者和50例健康對(duì)照。在發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證隊(duì)列中，慢性乙型肝炎病毒感染是HCC的主要原因，分別占65.4%和60%。與健康對(duì)照組相比，HCC患者年齡較大，血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶 (ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶 (AST)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶 (GGT)、堿性磷酸酶 (ALP)、直接膽紅素和凝血酶原時(shí)間 (PT) 水平較高。但總蛋白、白蛋白和血小板水平較低。對(duì)來(lái)自HCC患者的門(mén)靜脈和中央靜脈血清、癌組織及癌旁組織和糞便樣本（3種樣本類(lèi)型共360個(gè)樣本）以及來(lái)自正常受試者的門(mén)靜脈和中央靜脈血清、肝組織和糞便樣本（3種樣本類(lèi)型共300個(gè)樣本）共660個(gè)樣本通過(guò)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS）平臺(tái)進(jìn)行代謝組學(xué)檢測(cè)，根據(jù)血清、組織和糞便的代謝物變化進(jìn)行綜合分析，并在肝細(xì)胞系中驗(yàn)證候選代謝物的功能（圖 1）。

圖1. 代謝組學(xué)和生物驗(yàn)證研究流程

 

2. 與健康對(duì)照相比，在HCC患者中發(fā)現(xiàn)了代謝改變

在所有收集的樣品中共檢測(cè)到2799種代謝物，包括在發(fā)現(xiàn)隊(duì)列中，鑒定到156種(ESI–)和285種(ESI+)血清代謝物；305種(ESI–) 和535種(ESI+) 肝組織代謝物；440種(ESI–)和703種(ESI+) 糞便代謝物；在驗(yàn)證隊(duì)列中，鑒定到146種(ESI–)和229種(ESI+)血清代謝物。PLS-DA分析結(jié)果顯示，HCC患者與對(duì)照組個(gè)體具有不同的代謝物簇。通過(guò)擬合PLS-DA建立了一個(gè)包含代謝組學(xué)信息的模型，并通過(guò)200次隨機(jī)排列測(cè)試其在七次交叉驗(yàn)證期間正確分類(lèi)新樣本的能力。擬合優(yōu)度（R2）和預(yù)測(cè)優(yōu)度（Q2）的截距說(shuō)明PLS-DA模型是可靠的，并且沒(méi)有過(guò)度擬合。考慮到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異（p 值）和投影中的變量重要性（VIP），繪制了HCC患者中已識(shí)別代謝物水平相對(duì)于健康對(duì)照的倍數(shù)變化的火山圖，結(jié)果顯示在門(mén)靜脈血清、中央靜脈血清、HCC肝組織和糞便樣本中，與相應(yīng)的對(duì)照組相比，HCC患者的差異代謝物水平發(fā)生顯著改變。總之，HCC與門(mén)靜脈、中央靜脈、肝組織和糞便樣本等多種來(lái)源的代謝組的顯著變化有關(guān)（圖2）。

圖2. 在3種樣本類(lèi)型中均發(fā)現(xiàn) HCC 的代謝改變

 

3. HCC患者從門(mén)靜脈血清到中央靜脈血清的代謝發(fā)生變化

評(píng)估門(mén)靜脈和中央靜脈之間代謝物的相對(duì)變化，作為通過(guò)肝臟后變化的反映。比較從門(mén)靜脈到中央靜脈的代謝物在HCC患者和健康對(duì)照的差異。結(jié)果顯示，在HCC患者中發(fā)現(xiàn)17種代謝物，在正常對(duì)照組中發(fā)現(xiàn)12種代謝物，在兩種ESI模式中，從門(mén)靜脈到中心靜脈的減少變化為兩倍或更多�？傊�，門(mén)靜脈代謝改變不同于外周血代謝改變。門(mén)靜脈結(jié)果將為HCC發(fā)展過(guò)程中的代謝組學(xué)改變提供更多的見(jiàn)解(圖3)。

圖3. HCC 患者和健康對(duì)照組從門(mén)靜脈到中央靜脈的代謝物顯著降低

 

4. HCC患者門(mén)靜脈血清中的致病代謝物升高

為了揭示可能參與HCC形成的代謝表型，通過(guò)層次聚類(lèi)分析比較從門(mén)靜脈到中央靜脈血清樣本的代謝變化。發(fā)現(xiàn)與HCC中的中央靜脈相比，門(mén)靜脈中有56種代謝物顯著升高，在ESI–和ESI+模型中分別鑒定到28種。而且，HCC 患者門(mén)靜脈中鑒定出的這56種升高的代謝物也顯著高于健康對(duì)照。此外，這些升高的代謝物在獨(dú)立隊(duì)列中得到驗(yàn)證，與健康對(duì)照相比，其中25種在 HCC 患者的門(mén)靜脈血清中也升高。

進(jìn)行KEGG通路富集分析，并在ESI–和ESI+模型中確定顯著的富集通路，結(jié)果顯示，初級(jí)膽汁酸生物合成、牛磺酸和亞�；撬岽�謝以及苯丙氨酸和色氨酸代謝是HCC患者門(mén)靜脈代謝物中發(fā)生改變的主要通路。已報(bào)道，這些通路相關(guān)的代謝物有助于全身性肝臟炎癥。其中，L-色氨酸是一種重要的癌癥營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，去除它會(huì)導(dǎo)致腫瘤的破壞。使用HCC細(xì)胞系 Hep3B、Huh7和正常肝細(xì)胞細(xì)胞系MIHA對(duì)升高的門(mén)靜脈代謝物（如 L-色氨酸）進(jìn)行功能驗(yàn)證，結(jié)果顯示，L-色氨酸顯著促進(jìn)HCC細(xì)胞（Hep3B 和 Huh7）中的細(xì)胞增殖，但在MIHA中不以時(shí)間依賴(lài)性方式促進(jìn)細(xì)胞增殖�？傊�，門(mén)靜脈中升高的代謝物可能有助于HCC 的腫瘤發(fā)生（圖4）。

圖4. HCC患者門(mén)靜脈致病代謝物

 

5. HCC腫瘤組織中代謝物升高

與HCC患者的癌旁組織相比，在癌組織中鑒定出116種升高的代謝物，其中43種在ESI–模型中和73種在ESI+模型中被鑒定到。而且，與健康對(duì)照相比，116種升高的代謝物在HCC患者的腫瘤組織中也顯著更高。其中，與正常肝組織相比，HCC腫瘤組織中DL-3-苯基乳酸、L-色氨酸、甘氨膽酸和1-甲基煙酰胺的門(mén)靜脈代謝物也顯著升高。將這些代謝物的水平與肝功能的生化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，DL-3-苯基乳酸、甘氨膽酸和1-甲基煙酰胺與血清AST、ALT、ALP、GGT、血清總膽紅素和PT水平呈正相關(guān)，與血清白蛋白和血小板水平呈負(fù)相關(guān)，表明HCC患者門(mén)靜脈和腫瘤組織中代謝物升高與肝功能受損有關(guān)。

隨后根據(jù)這4個(gè)代謝物的濃度中位值將HCC患者分為高與低類(lèi)別。當(dāng)根據(jù)單個(gè)代謝物的中位值對(duì)隊(duì)列進(jìn)行二分位時(shí)，DL-3-苯乳酸的總體死亡率危險(xiǎn)比為3.975，L-色氨酸為 3.662 ，甘膽酸為 3.975，1-甲基煙酰胺為 3.487，表明HCC患者門(mén)靜脈和腫瘤組織中升高的代謝物與生存率降低有關(guān)（圖 5）。

圖5. 驗(yàn)證HCC腫瘤組織中的致病代謝物

 

6. HCC患者門(mén)靜脈中降低的代謝物在體外對(duì) HCC 具有保護(hù)作用

最后，評(píng)估HCC患者門(mén)靜脈樣本中降低的代謝物，并與相同患者糞便樣本中降低的代謝物的交集情況，結(jié)果顯示，與發(fā)現(xiàn)隊(duì)列中的健康對(duì)照相比，亞油酸和苯酚在 HCC 患者的門(mén)靜脈血清和糞便樣本中均顯著減少，并在驗(yàn)證隊(duì)列中的 HCC 患者的門(mén)靜脈血清樣本中得到證實(shí)。對(duì)HCC 細(xì)胞系中亞油酸和苯酚進(jìn)行功能研究，結(jié)果顯示，亞油酸和苯酚均以時(shí)間依賴(lài)性方式顯著抑制HCC細(xì)胞系Hep3B和Huh7中的細(xì)胞增殖，但不抑制正常肝細(xì)胞系MIHA的細(xì)胞增殖；同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)亞油酸和苯酚顯著抑制 HCC細(xì)胞系Hep3B和Huh7的集落形成；此外，亞油酸和苯酚增加HCC 細(xì)胞的凋亡。總之，亞油酸和苯酚抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo) HCC 細(xì)胞凋亡，推斷它們的抗 HCC 功能是保護(hù)性代謝物（圖 6）。

圖6. 體外HCC潛在保護(hù)性代謝物的驗(yàn)證

小結(jié)

本研究招募發(fā)現(xiàn)隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列，收集HCC患者和健康對(duì)照的血清（門(mén)靜脈和中央靜脈）、肝臟組織和糞便樣本進(jìn)行了深入的綜合代謝組學(xué)分析。闡述了HCC 患者先前未報(bào)告的代謝改變。在門(mén)靜脈（腸道和肝臟之間的關(guān)鍵體液通訊途徑）中，確定了升高的致病性代謝物和降低的保護(hù)性代謝物，表明它們?cè)贖CC發(fā)展中的關(guān)鍵作用。

參考文獻(xiàn)

Integrative metabolomic characterisation identifies altered portal vein serum metabolome contributing to human hepatocellular carcinoma. Gut. 2021. https://doi.org/10.1136/gutjnl-2021-325189.

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