研究重點解析：

1. 在慢性HF患者中，植入LVAD后心肌恢復且MPC表達增加

2. MPC缺失足以誘導心肌肥大和HF

3. MPC過表達則減弱藥物誘導的肥大

4. 線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運失衡是誘導心肌細胞肥大的充分必要條件

5. 抑制MCT4可以減輕細胞和小鼠的心肌肥大
 

心力衰竭（heart failure，HF）是一種復雜的慢性心臟病，其特征是心臟的泵血或血液再灌注能力降低，已成為全球死亡的主要原因。HF的發(fā)生通常以病理性心肌肥大為先導征兆。晚期HF患者的治療主要是侵入性手術，例如心臟移植和左心室輔助裝置（LVAD）植入，以此通過機械支持恢復足夠的血流量和血液動力學。然而植入LVAD后一部分患者有效而另一部分患者卻效果不佳，其原因尚不清楚。來自美國猶他大學Stavros G. Drakos和Jared Rutter團隊利用RNA測序、葡萄糖示蹤及代謝組學等技術發(fā)現(xiàn)，在慢性HF患者中，植入LVAD后心肌恢復伴隨著MPC（線粒體丙酮酸載體）表達增加，同時揭示了丙酮酸-乳酸軸的改變是心臟肥大和心力衰竭的早期特征，抑制MCT4可以改善HF，相關研究成果發(fā)表于《Cell Metabolism》。

線粒體丙酮酸載體(MPC)是MPC1和MPC2的異二聚體復合體，它將糖酵解的產(chǎn)物丙酮酸運輸?shù)骄�粒體，在線粒體中通過丙酮酸脫氫酶(PDH)和三羧酸（TCA）循環(huán)完全氧化。MPC亞基在正常成人心臟中高表達，可能是決定丙酮酸氧化或胞質(zhì)轉(zhuǎn)化為乳酸的關鍵節(jié)點。
 

一. MPC1缺失促進心肌肥大導致HF

晚期慢性心力衰竭患者植入LVAD后，患者被分為有應答者和無應答者（應答者組定義為LVEF增加大于50%，LVEDD 小于6.0 cm，無響應組定義為LVEF增加小于50%，無論LVEDD是否改變）。植入LVAD后，與無應答者不同，有應答組的心肌收縮功能指標（LVEF）顯著增加，而心臟大小指標（LVEDD）顯著減少。收集并分析兩組HF患者在植入LVAD前和植入LVAD后的左心室組織，以明確應答者心力衰竭恢復的機制。MPC1豐度檢測結(jié)果顯示，與供體對照組相比，在植入LVAD前，應答組和非應答組的心肌組織中MPC1均降低；而植入LVAD后，心肌組織中MPC1在應答組中增加，但在無應答組的MPC1豐度不變。檢測丙酮酸脫氫酶(PDH)的磷酸化程度（PDH被磷酸化后失活，去磷酸化后激活），結(jié)果顯示，在應答組中，與供體對照組相比，在植入LVAD 前顯著升高，在植入LVAD 后降低并接近對照水平；而在無應答組植入LVAD前和后，與供體對照組相比，PDH磷酸化程度均增加，導致PDH失活，提示丙酮酸氧化受到抑制，可能存在一種潛在的代謝病因，以線粒體丙酮酸代謝缺陷為中心導致心衰。
 

由于MPC在HF患者中較低，而在應答者植入LVAD后增加，那么MPC表達的改變是否對HF和康復有因果關系？為了確定MPC缺失是否足以在體內(nèi)誘導HF，構(gòu)建心臟特異性和他莫昔芬誘導的MPC1敲除小鼠(MPC1CKO)，MPC1敲除小鼠表現(xiàn)為心臟特異性和他莫昔芬誘導的MPC1和MPC2蛋白的缺失。在他莫昔芬治療1周后，對這些小鼠進行連續(xù)的超聲心動圖檢查，結(jié)果顯示，注射他莫昔芬1周后MPC1敲除小鼠與野生型(WT)幼崽無區(qū)別；而在誘導9周后(9 wpi)， MPC1敲除小鼠表現(xiàn)出擴張性心肌病，到16 wpi時進展為明顯的心衰。組織切片結(jié)果表明，與WT小鼠相比，MPC1敲除小鼠的心臟橫斷面積增加。從13wpi開始左室重量增加，也提示MPC1敲除小鼠的心肌肥大。在13 wpi后，MPC1敲除小鼠體重顯著下降，之后開始死亡，并在18 wpi時全部死亡。綜上所述，小鼠中MPC1缺失足以引起心肌肥大和心衰（圖1）。

圖1. MPC1缺乏足以促進心肌肥大并導致心力衰竭
 

二. MPC缺失導致早期肥大和最終線粒體衰竭

將8 wpi(肥大前)和16 wpi(心衰后)的對照組和MPC1敲除小鼠的心臟組織進行RNA測序，并對差異上調(diào)基因進行GO分析，結(jié)果顯示，與WT小鼠相比，MPC1敲除小鼠中參與心肌細胞發(fā)育、膠原組織、細胞分裂和損傷反應的基因表達均上調(diào)，在8周上調(diào)明顯，并在16周進一步加強，提示肥大前基因調(diào)控程序的啟動。當檢查單個基因時，與WT小鼠相比，MPC1敲除小鼠中與心肌肥大和糖酵解相關的基因表達顯著升高，與TCA循環(huán)酶相關基因表達降低；還發(fā)現(xiàn)，在8 wpi和16 wpi時，丙酮酸代謝相關基因調(diào)控失調(diào)。MPC1敲除小鼠的左室組織透鏡(TEM)結(jié)果顯示，在8 wpi時，線粒體結(jié)構(gòu)正常；而在16 wpi時，線粒體嵴不規(guī)則，染色強度較高。綜上所述，雖然MPC的缺失引起了代謝基因表達的早期代償性變化，但最終還是導致線粒體功能紊亂，發(fā)生HF和死亡（圖2）。

圖2. MPC丟失是一種心衰的早期損傷
 

三. 線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運失衡是誘導心肌細胞肥大的必要條件

如果MPC活性的喪失是心肌細胞肥大的早期損傷誘因，那么MPC的過表達可能會導致對誘導肥大藥物的抵抗。用MPC過表達載體(MPC OE)或空白載體(EV)轉(zhuǎn)染H9c2細胞（它可以分化成具有許多心肌細胞特征的細胞），同時使用肥大誘導藥物苯腎上腺素(PE)、異丙腎上腺素(ISO)和血管緊張素(ATII)以及MPC抑制劑UK-5099 (UK)處理MPC OE和EV細胞，結(jié)果顯示，MPC OE可以減輕所有四種藥物誘導的細胞肥大。由于MPC是一種蛋白質(zhì)復合物，它將胞質(zhì)丙酮酸轉(zhuǎn)運到線粒體基質(zhì)中，并沒有內(nèi)在的酶活性。因此，切斷這種聯(lián)系就足以促進肥大。為了證實這一點，使用葡萄糖示蹤技術分析上述相同實驗條件下碳水化合物代謝通量的變化，結(jié)果顯示，在UK、MPC1 KD（敲低，基因干擾）和PE處理的H9c2細胞中，細胞內(nèi)和細胞外同位素標記的乳酸均增加，而同位素標記的檸檬酸在TCA循環(huán)中下降。這些代謝擾動不只在MPC抑制或敲低后發(fā)生，也在PE處理后發(fā)生。且MPC OE處理后，則逆轉(zhuǎn)了 PE 誘導的 TCA 循環(huán)中間體的降低，同時防止了細胞肥大，這進一步支持了這種代謝轉(zhuǎn)移對細胞肥大的必要性（圖3）。

圖3. 線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運的喪失是誘導培養(yǎng)心肌細胞肥大的必要條件
 

四. 線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運失衡是誘導心肌細胞肥大的充分條件

為了更好地了解代謝通量變化、肥大和 HF 之間的關系，從MPC1敲除小鼠中分離培養(yǎng) ACMs（成年小鼠心肌細胞）。在心肌結(jié)構(gòu)或功能顯著異常前(12 wpi)和心衰發(fā)作后(16 wpi)分別分離心肌細胞，并進行葡萄糖示蹤實驗。結(jié)果表明，與MPC活性喪失一致，在12 wpi時，MPC1敲除的ACMs細胞中，標記的乳酸增加，檸檬酸減少，而TCA循環(huán)中間體富馬酸和琥珀酸的標記不受影響。同時，還發(fā)現(xiàn)標記的丙氨酸水平正常，它的胞質(zhì)生成和線粒體輸入可以作為MPC獨立的替代機制，通過這種機制，糖酵解的碳得以供給TCA循環(huán)。而在16 wpi時，進入TCA循環(huán)的標記消失，丙氨酸標記減少，乳酸輸出進一步增加。這表明，線粒體丙酮酸攝取的減少足以在體外引起心肌細胞肥大，線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運失衡是誘導心肌細胞肥大的充分條件（圖4）。

圖4. MPC1CKO小鼠肥大和HF前糖酵解通量的動態(tài)變化
 

五. 抑制MCT4可預防和逆轉(zhuǎn)心肌細胞肥大

已有文獻報道單羧酸轉(zhuǎn)運體(MCT)家族的成員MCT4在肥大和HF中高表達，從而將乳酸從細胞中排出。作者開發(fā)一種MCT4抑制劑VB124，它可以特異性地抑制乳酸流出，從而將糖酵解碳通量轉(zhuǎn)向線粒體丙酮酸氧化。假設抑制MCT4阻斷了肥大心肌細胞的乳酸外流，導致糖酵解碳通量轉(zhuǎn)向線粒體丙酮酸氧化，進而逆轉(zhuǎn)心肌肥大。為了驗證這一假設，將PE和VB124同時作用于H9c2細胞48h，結(jié)果表明，抑制MCT4可以阻止PE誘導的細胞肥大。為了確定MCT4抑制是否不僅能阻止PE誘導的細胞肥大，而且還能逆轉(zhuǎn)肥大，我們用PE預處理H9c2細胞48小時，然后再聯(lián)合PE和VB124處理48小時，結(jié)果表明，MCT4抑制完全逆轉(zhuǎn)了這些細胞的肥大表型。用PE和ISO處理ACMs，同樣發(fā)現(xiàn)VB124阻止了ACMs細胞的肥大表型。抑制MCT4后的逆轉(zhuǎn)效應，以及MPC過表達的抗肥大效應，均體現(xiàn)了心肌細胞線粒體丙酮酸代謝的重要性，這與植入LVAD的患者中觀察到的MPC豐度增加一致。葡萄糖示蹤實驗也表明，VB124 可防止在 H9c2 和 ACM 細胞中用 PE 或 ISO 處理引起的代謝異常，VB124 降低了向乳酸的葡萄糖通量，并增加了進入檸檬酸鹽和 TCA 循環(huán)的葡萄糖通量。在經(jīng)PE預處理、隨后經(jīng)VB124處理的細胞中也發(fā)現(xiàn)了TCA循環(huán)通量的增加。綜上所述，抑制MCT4可以逆轉(zhuǎn)藥物誘導的心肌細胞肥大（圖5）。

圖5. 抑制MCT4可預防和逆轉(zhuǎn)心肌細胞肥大
 

六. 維持線粒體丙酮酸可防止心肌細胞肥大

構(gòu)建穩(wěn)定表達線粒體特異性標簽(Mito-tag)的H9c2細胞，該標簽能夠快速分離和提取線粒體，這是量化線粒體內(nèi)代謝物改變的必要條件。檢測到心肌肥大藥物刺激導致穩(wěn)態(tài)丙酮酸水平下降，而MCT4抑制又恢復了穩(wěn)態(tài)丙酮酸水平。然而，在線粒體中未檢測到乳酸，這與乳酸主要是一種細胞質(zhì)代謝物的觀點一致。線粒體丙酮酸含量的這種模式與全細胞提取物中趨勢相反，在全細胞提取物中，UK、PE和ISO刺激導致丙酮酸和乳酸的增加，而MCT4抑制則逆轉(zhuǎn)了這種情況。為了確定這種丙酮酸可能是糖酵解的來源，我們將Mito-tag標簽方法與葡萄糖示蹤組合，并觀察到丙酮酸同位素在未處理的細胞中呈現(xiàn)高豐度，而在UK、PE和ISO處理中未檢測到，且在MCT4抑制時再次出現(xiàn)。與之前的實驗一致，任何情況下均未檢測到標記的乳酸，這表明糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸而非乳酸進入線粒體并為這些細胞的TCA循環(huán)提供燃料。同時對這些Mito-tag細胞進行不同時間梯度的葡萄糖示蹤實驗，再次觀察到VB124處理后糖酵解進入TCA循環(huán)的通量增加。除了丙酮酸-乳酸軸的變化，還觀察到在PE、ISO和UK處理的細胞中，線粒體中穩(wěn)態(tài)谷氨酸增加，天冬氨酸減少，且MCT4抑制后，線粒體天冬氨酸和谷氨酸水平則完全逆轉(zhuǎn)。同時也在全細胞裂解物中獲得相反趨勢，進一步強調(diào)了心肌細胞中分室化線粒體代謝的重要性。 
 

糖酵解通量增加和細胞呼吸下降是心肌細胞肥大的常見現(xiàn)象。線粒體膜電位是ATP產(chǎn)生和蛋白質(zhì)輸入所必需的，是線粒體整體健康的可靠標志。與此一致， ISO處理后，成年心肌細胞線粒體膜電位下降，而VB124處理完全逆轉(zhuǎn)了成年心肌細胞的膜電位。而且這些細胞在ISO處理后活性氧(ROS)升高，而VB124處理后發(fā)生逆轉(zhuǎn)。綜上所述，MCT4抑制可減輕和逆轉(zhuǎn)心肌細胞肥大，使線粒體氧化代謝正�；�（圖6）。

圖6. MCT4抑制補充線粒體丙酮酸通量，提高線粒體膜電位，減輕細胞溶質(zhì)ROS
 

七. 抑制MCT4可減輕ISO誘導的小鼠心肌肥大

考慮到抑制MCT4逆轉(zhuǎn)了PE、ISO和UK體外治療后的心肌細胞肥大，于是在心肌肥大的小鼠模型上再次驗證。通過外科手術將小鼠植入滲透微型泵，連續(xù)輸送Veh或ISO以誘導小鼠肥大，同時通過每日小鼠灌胃VB124或Veh，持續(xù)4周。在4周結(jié)束時對這些小鼠進行了超聲心動圖檢查，并在死后收集心臟樣本。與細胞結(jié)果一致，注射ISO引起心臟體重比和LVEDD顯著增加，抑制MCT4時，則發(fā)生逆轉(zhuǎn)。
 

從ISO 和 VB124 處理的小鼠中分離出的整個心臟樣本進行代謝組學檢測，層次聚類結(jié)果顯示了ISO 處理導致的代謝變化，而 VB124 處理則逆轉(zhuǎn)了這些變化，且主成分（PCA）分析結(jié)果顯示，抑制MCT4足以使經(jīng)過ISO處理的小鼠心臟的代謝譜恢復到與未經(jīng)處理的對照組同等的水平。在ISO誘導的肥大中，糖酵解中間體增加，再用VB124處理后，則恢復到對照水平。心肌左室組織透鏡分析顯示，ISO處理導致線粒體結(jié)構(gòu)畸變，而VB124處理改善了線粒體結(jié)構(gòu)畸變，而VB124處理后則恢復。綜上所述，抑制MCT4逆轉(zhuǎn)了ISO誘導的心肌肥大的多種病理特征，包括代謝紊亂和線粒體結(jié)構(gòu)損傷（圖7）。

圖7. MCT4抑制可防止小鼠心肌肥大
 

小結(jié)：

本研究發(fā)現(xiàn)，在植入LVAD的慢性心衰患者中，心臟恢復與心臟組織中MPC豐度的增加相關。相反，成年小鼠MPC基因缺失足以誘發(fā)心肌肥大、慢性心衰和死亡。此外，在多個體外心肌細胞模型中，MPC缺失足以誘導心肌肥大，而MPC過表達可減輕藥物誘導的心肌肥大。研究還發(fā)現(xiàn)乳酸輸出劑MCT4的活性在代謝上抑制MPC，是心肌肥大所必需的。本研究還開發(fā)了一種新型、有效的MCT4抑制劑，可以預防和逆轉(zhuǎn)細胞和小鼠的心肌肥大。通過葡萄糖示蹤實驗和代謝組學的結(jié)合，我們發(fā)現(xiàn)線粒體丙酮酸氧化減少與心肌細胞肥大緊密相關。總之，本研究揭示了丙酮酸-乳酸代謝軸是心肌細胞生長和功能的一個關鍵調(diào)控節(jié)點，為心肌肥大疾病的有效治療和開發(fā)高效的MCT4抑制劑提供新策略。
 

繪譜幫你測：

通過葡萄糖示蹤實驗和代謝組學的結(jié)合，上述研究發(fā)現(xiàn)線粒體代謝改變與心肌細胞肥大表型緊密相關。質(zhì)譜代謝組學可對生物樣品中的數(shù)千個小分子進行全面、系統(tǒng)的分析，可以靈敏捕捉到機體代謝的細微變化，是尋找線粒體相關疾病的理想生物標志物或藥物靶標的最新技術。代謝組學可用于分析線粒體功能障礙的眾多上下游效應，包括能量代謝、氧化應激、NAD/NADH氧化還原失衡和能量缺乏在機體系統(tǒng)中的變化。文中涉及的線粒體代謝及其所有相關小分子代謝物檢測，麥特繪譜均可提供全套解決方案！歡迎掃碼聯(lián)系我們?nèi)〉迷敿氋Y料。
 

參考文獻：

The pyruvate-lactate axis modulates cardiac hypertrophy and heart failure. Cell Metabolism. 2020. https://doi.org/10.1016/j.cmet.2020.12.003
 

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