蛋白歸一化在Western Blot中的應(yīng)用
 

在Western Blot（WB）實驗中，歸一化是實驗數(shù)據(jù)處理的關(guān)鍵步驟。WB實驗常設(shè)計不同的內(nèi)部對照或檢查點，對樣本或者實驗中的偏差進行監(jiān)控、修正。在WB中的偏差通常來自蛋白樣本濃度不均、凝膠上樣不一致或轉(zhuǎn)膜不完全。這些不一致性可以通過凝膠和膜的可見光或熒光標(biāo)記法監(jiān)控，用泳道總蛋白或內(nèi)參蛋白（比如GAPDH、β-tubulin、β-actin或cyclophilin B）進行歸一化校正, 來保證實驗結(jié)果的可靠性。接下來由我給大家介紹下兩者的不同。

內(nèi)參蛋白校正
使用內(nèi)參蛋白校正是目前比較成熟的一種手段。具體校正方法就是在各蛋白樣品中選一種表達量保持一致的蛋白作為內(nèi)參蛋白（一般是管家基因），將每個樣品目的蛋白含量與內(nèi)參蛋白含量相除，得到每個樣品目的蛋白的相對含量。再進行樣品與樣品之間的比較。

例：當(dāng)前有三份蛋白樣品S1、S2、S3，選擇的內(nèi)參基因為Control，需要檢測目的蛋白Test在這三份樣品中的相對表達量。

經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育、清洗等一系列實驗操作后，獲得一張蛋白印跡膜。用GelView 6000 Pro全自動化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)或GelView 6000Plus智能圖像工作站進行顯影成像，獲得的發(fā)光圖。如圖1所示：
 

圖1

BioAnaly分析軟件具有蛋白歸一化分析功能，可以直接輸出蛋白歸一化結(jié)果，不需要進行額外的操作，方便快捷，如圖2所示：
 

圖2
 

最終得到實驗結(jié)果如圖3所示：

圖3

如果僅看三個樣品中目的蛋白的灰度值（如圖3中藍色數(shù)據(jù)條所示），會發(fā)現(xiàn)其發(fā)光強度基本一致。此時并不能判斷目的蛋白的含量一致，因為內(nèi)參蛋白的灰度值相差較大（如圖3中橙色數(shù)據(jù)條所示），因此還需要通過內(nèi)參蛋白進行校正，將內(nèi)參蛋白的灰度值歸一化，可得到三個樣品中目的蛋白的真實灰度值，該結(jié)果才能比較準(zhǔn)確地反映目的蛋白的含量。計算結(jié)果如圖4所示：
 

圖4

通過內(nèi)參蛋白校正后發(fā)現(xiàn)待測蛋白在三個樣品中的相對表達量呈梯度上升趨勢。

總蛋白校正
總蛋白校正是一種新興的實驗策略。具體校正方法就是直接測量樣品中總蛋白的含量（通過非特異性蛋白染料對泳道中所有蛋白進行染色測定），將每個樣品目的蛋白含量與總蛋白含量相除，得到每個樣品目的蛋白的相對含量。再進行樣品與樣品之間的比較。

例：當(dāng)前有四份蛋白樣品S1、S2、S3、S4，需要檢測目的蛋白Test在這四份樣品中的相對表達量（本次實驗中使用的非特異性熒光染料，可以對所有蛋白進行染色；二抗為FITC熒光標(biāo)記）。

經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育、清洗等一系列實驗操作后，獲得一張蛋白印跡膜。

用GelView 6000Plus智能圖像工作站的熒光模塊進行熒光成像，結(jié)果如圖5所示，泳道內(nèi)所有蛋白均產(chǎn)生熒光，熒光強度可以代表樣品總蛋白的含量：
 

圖5
 

通過分析軟件BioAnaly計算灰度值，得到實驗數(shù)據(jù)，如圖6所示：
 

圖6
 

使用475nm的藍光（不同熒光染料所需波長參照試劑的使用說明）激發(fā)目的蛋白Test，結(jié)果如圖7所示:
 

圖7
 

通過分析軟件BioAnaly計算發(fā)光強度，得到實驗數(shù)據(jù)，如圖8所示：
 

圖8

從上圖可以看出，目的蛋白在S3中的發(fā)光強度最大，接近S2的2.5倍。然而經(jīng)過蛋白歸一化后，結(jié)果，如圖9所示：
 

圖9

我們不難發(fā)現(xiàn)目的蛋白在四份樣品中表達量基本一致，所以我們說蛋白歸一化是必須的。相應(yīng)的，BioAnaly分析軟件也可以直接對總蛋白進行歸一化分析。

兩種方法的對比
內(nèi)參蛋白校正
優(yōu)點
1、發(fā)展時間久，技術(shù)成熟；
2、成本低，不需要額外的染色；

缺點
1、需要根據(jù)不同的組織選擇不同的內(nèi)參蛋白，以保證樣品間的一致性；
2、內(nèi)參蛋白大小與目的蛋白大小相差5KD以上，防止發(fā)光時互相干擾；
3、內(nèi)參蛋白與目的蛋白表達量不能相差過大，防止內(nèi)參蛋白曝光過度；
4、需要證明內(nèi)參蛋白本身的表達量在各樣品間保持一致；

總蛋白校正
優(yōu)點
1、適用于任何組織樣本；
2、具有更好的說服力，投稿更方便；

缺點
1、染料具有一定的線性范圍，需要一定程度上控制上樣量；
2、每次都需要對整張膜進行染色，試劑使用量大；

總結(jié)
在Western Blot實驗中，歸一化處理是關(guān)鍵步驟，歸一化以后才能進行蛋白濃度的對比。其中，內(nèi)參蛋白校正由于其發(fā)展時間久、成本低等優(yōu)點，受眾多，積累了大量的使用經(jīng)驗，同時有豐富的試劑種類可供選擇，對于常規(guī)實驗對象的研究是最佳方法；總蛋白校正則是直接測得整個泳道（樣本）內(nèi)所有蛋白的含量，不用擔(dān)心內(nèi)參蛋白本身帶來的誤差，對于沒有參考資料的新樣本來說十分適合。所以，兩者是相輔相成的，大家可以根據(jù)自己的實際情況進行選擇。

除了選擇合適的歸一化方法以外，一臺高靈敏度的光信號捕捉設(shè)備也是獲得理想實驗數(shù)據(jù)所必需的。博鷺騰公司在光子信號的高效率識別接收領(lǐng)域有著多年的研發(fā)經(jīng)驗，旗下的GelView6000系列產(chǎn)品配備了科研級冷CCD相機、多色熒光光源以及功能強大的BioAnaly分析軟件，能對泳道內(nèi)的蛋白做精準(zhǔn)的定量和定性分析，完全兼容這兩種歸一化方法的需求，并且設(shè)備操作簡便，5分鐘即可上手，歡迎各位老師咨詢試用。

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