用于病毒載體生產(chǎn)的可放大、高性能一次性使用生物反應(yīng)器技術(shù)
案例研究：基于腺相關(guān)病毒的基因治療
M. Duyck, Y. Dohogne, R. Lievrouw, N. Jafar, F. Kasper, J. Wielgomas, A. Aare, K. Barglow, J. Castillo
 
摘要
最近基因療法的成功導(dǎo)致了對(duì)病毒載體的需求激增，超過(guò)了目前的生產(chǎn)能力。然而，使用傳統(tǒng)技術(shù)(如攪拌槽、靜態(tài)細(xì)胞培養(yǎng))生產(chǎn)病毒載體的方法存在一些局限性，包括可放大性有限、靈活性差、生產(chǎn)成本高。
 
為了應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)，Univercells開(kāi)發(fā)了一次性使用固定床scale-X™生物反應(yīng)器，用于增強(qiáng)病毒產(chǎn)品的上游工藝。scale-X產(chǎn)品組合通過(guò)工程設(shè)計(jì)，提供了系統(tǒng)的線性放大性，可適應(yīng)從工藝開(kāi)發(fā)到大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)的病毒式生產(chǎn)。
 
4DMT, Inc.是一家處于開(kāi)發(fā)階段的精準(zhǔn)基因治療公司，致力于基于下一代AAV載體的開(kāi)創(chuàng)性靶向治療的開(kāi)發(fā)。4DMT的專(zhuān)利治療性載體進(jìn)化平臺(tái)使“疾病優(yōu)先”的產(chǎn)品發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)方法成為可能，從而允許定制AAV載體，以靶向與潛在疾病相關(guān)的特定組織類(lèi)型。這些專(zhuān)利AAV載體旨在通過(guò)常規(guī)臨床途徑實(shí)現(xiàn)靶向遞送、高效轉(zhuǎn)導(dǎo)、降低免疫原性以及針對(duì)已有抗體的耐受性。
 
在這項(xiàng)研究中，使用HEK293細(xì)胞和4DMT載體的rAAV工藝從靜態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到了Univercells 的scale-X生物反應(yīng)器。我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分布均勻，病毒滴度增加，從而顯著減少了生產(chǎn)時(shí)間和成本。

 
1. scale-X^TM一次性使用固定床生物反應(yīng)器 
Scale-X生物反應(yīng)器系統(tǒng)是基于可增強(qiáng)均質(zhì)性的緊湊且結(jié)構(gòu)化固定床的一次性使用生物反應(yīng)器（圖1）。該系統(tǒng)提供自動(dòng)參數(shù)控制，并允許輕松進(jìn)行培養(yǎng)基和細(xì)胞取樣。
 
生物反應(yīng)器與在線TFF產(chǎn)物濃縮在收獲瓶中鏈接，從而消除了初步澄清步驟。

圖1. Scale-X carbo生物反應(yīng)器示意圖。
  
產(chǎn)品范圍包括工藝開(kāi)發(fā)（scale-X hydro，2.4 m²）、中試規(guī)模培養(yǎng)（scale-X carbo，10和30 m²）以及中到大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)（scale-X nitro， 200-600 m²）。Scale-X nitro生物反應(yīng)器是目前市面上最大的固定床系統(tǒng)，已集成到NevoLine™生物制造平臺(tái)中，可滿(mǎn)足基因治療病毒載體的需求（圖2）。
 

圖2. Scale-X生物反應(yīng)器產(chǎn)品范圍以及集成至NevoLine生產(chǎn)平臺(tái)。
 
 
2. 材料和方法
 
Scale-X
>> Scale-X hydro生物反應(yīng)器（2.4m2 生長(zhǎng)面積）
>> 培養(yǎng)：來(lái)自?xún)龃婕?xì)胞庫(kù)的HEK293細(xì)胞，接種至塑料平面培養(yǎng)瓶，于37℃、5% CO2孵育
>> 鏈接的TFF：WaterSep中空纖維過(guò)濾器，MWCO 100kD，表面積1300 cm²，目標(biāo)體積濃縮因子（VCF）：10-15
 
對(duì)照
>> Corning Cell Stack 1層（CS1）作為對(duì)照組#1-4；
>> 在37°C、5% CO2的加濕培養(yǎng)箱中操作，使用相同的接種密度以及培養(yǎng)基比例體積
 
方法
>> 細(xì)胞密度確定使用重復(fù)組的胰蛋白酶消化(對(duì)照組)
>> 在scale-X生物反應(yīng)器中，細(xì)胞密度確定使用結(jié)晶紫染色并計(jì)數(shù)玻片上的細(xì)胞核
>> 使用PEI進(jìn)行三重轉(zhuǎn)染
>> 使用ddPCR檢測(cè)病毒滴度

細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染工藝
圖3所示為在scale-X hydro生物反應(yīng)器中進(jìn)行的細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染工藝。工藝轉(zhuǎn)移后，對(duì)初步工藝優(yōu)化進(jìn)行評(píng)估：
>> 實(shí)驗(yàn)#1：直接從培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到scale-X生物反應(yīng)器。
>> 實(shí)驗(yàn)#2：評(píng)估pH值變化對(duì)產(chǎn)量的影響。
>> 實(shí)驗(yàn)#3：降低接種細(xì)胞密度，優(yōu)化轉(zhuǎn)染試劑的用量。
>> 實(shí)驗(yàn)#4：通過(guò)減少生長(zhǎng)培養(yǎng)基以及在收獲期間引入第三次漂洗，以進(jìn)一步優(yōu)化工藝。批次中引入TFF病毒濃縮，而去除初步澄清。
 

圖3. 在scale-X生物反應(yīng)器（2.4 m2）中實(shí)驗(yàn)設(shè)置的工藝流程示意圖
 

  
 
3.在scale-X hydro生物反應(yīng)器中均勻的細(xì)胞分布

>> HEK293細(xì)胞在固定床中呈均勻的軸向和徑向分布(圖4)，使可用于細(xì)胞生長(zhǎng)的表面積得到最佳利用。
>> Scale-x固定床的取樣代表了整個(gè)固定床內(nèi)細(xì)胞的平均密度。
  圖4. Scale-X hydro生物反應(yīng)器中的軸向和徑向HEK293 細(xì)胞分布
 
 
4. 細(xì)胞生長(zhǎng)、病毒表達(dá)和鏈接的濃縮
 
概念驗(yàn)證和優(yōu)化目標(biāo)
1. 參考工藝適應(yīng)scale-X技術(shù)
2. 確定和優(yōu)化關(guān)鍵工藝參數(shù)，以實(shí)現(xiàn)高rAAV產(chǎn)量
3. 使用鏈接/在線TFF進(jìn)行病毒濃縮
 
細(xì)胞生長(zhǎng)
>>在4個(gè)實(shí)驗(yàn)中，生物反應(yīng)器中HEK293細(xì)胞的生長(zhǎng)性能與平面對(duì)照組相似(圖5)，達(dá)到了較高的細(xì)胞密度(>在收獲當(dāng)天增加了14倍)。
>>沒(méi)有觀察到針對(duì)工藝優(yōu)化而進(jìn)行的變化到對(duì)培養(yǎng)的負(fù)面影響：pH值 (#1：7.2，#2-4：7.0)以及生長(zhǎng)階段體積/表面比降低(# 4降低了2倍)。
  圖5. 生長(zhǎng)于scale-X hydro生物反應(yīng)器和塑料平面培養(yǎng)瓶對(duì)照組中HEK293 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的比較
 
鑒別和優(yōu)化關(guān)鍵工藝參數(shù)，以獲得高rAAV產(chǎn)量

>>工藝轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)(#1)獲得產(chǎn)量達(dá)平均參考的45%，在預(yù)期的范圍內(nèi)。
>>實(shí)驗(yàn)#2的收率結(jié)果顯示，低pH沒(méi)有影響，可允許在整個(gè)工藝過(guò)程中使用更低量的堿。
>>實(shí)驗(yàn)3的結(jié)果與運(yùn)行#1和2的結(jié)果相似，盡管在轉(zhuǎn)染時(shí)，基于較低的細(xì)胞密度，轉(zhuǎn)染的DNA和PEI濃度降低了3倍。
>>實(shí)驗(yàn)條件#4的產(chǎn)量與參考工藝相似(98%)，即使在生長(zhǎng)階段培養(yǎng)基體積減少。
>>4DMT在其它替代性填充床生物反應(yīng)器技術(shù)中進(jìn)行了一組實(shí)驗(yàn)。測(cè)試了各種培養(yǎng)條件，總體上表明與參考工藝相比，平均產(chǎn)量?jī)H為25%。
→實(shí)驗(yàn)表明，從平面培養(yǎng)設(shè)備到我們的可放大技術(shù)的工藝轉(zhuǎn)移容易實(shí)現(xiàn)。
→只需進(jìn)行較少的工藝優(yōu)化，即可在scale-X生物反應(yīng)器獲得相似的滴度。
  圖6. scale-X hydro生物反應(yīng)器、CS10中的平均參考值以及替代性填充床生物反應(yīng)器中的rAAV滴度比較
不同條件的替代性填充床生物反應(yīng)器（1.6 m²，n=1；4 m²，n=6）
 
工藝規(guī)模放大和鏈接的TFF濃縮
 
實(shí)驗(yàn)結(jié)果可擴(kuò)展至大規(guī)模生產(chǎn)，包括參考工藝和優(yōu)化工藝(圖7)。Scale-X hydro生物反應(yīng)器(2.4m²)的實(shí)驗(yàn)體積可擴(kuò)展至scale-X carbo和nitro系統(tǒng)(在初始實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上總體積減少25%)。
 
>>Scale-X狹窄的固定床可捕獲主要雜質(zhì)，并作為預(yù)澄清，從而去除初始的澄清步驟，并允許使用TFF直接濃縮產(chǎn)物。
>>采用在線濃縮，可大幅降低收獲體積，在大規(guī)模條件下，從參考工藝的1,215 L降低到80 L。
    →這種幅度的體積降低對(duì)工藝成本和時(shí)間可產(chǎn)生積極的影響。  
 
總結(jié)和未來(lái)步驟
 
>>成功地將細(xì)胞培養(yǎng)工藝從靜態(tài)塑料器皿轉(zhuǎn)移到固定床生物反應(yīng)器，從而實(shí)現(xiàn)了低占地和高經(jīng)濟(jì)效益的生產(chǎn)

>>通過(guò)少量實(shí)驗(yàn)即可實(shí)現(xiàn)初步工藝強(qiáng)化：
•降低細(xì)胞接種密度→縮短種子擴(kuò)增過(guò)程
•減少三倍的DNA和PEI用量→降低物料成本
•生長(zhǎng)階段更低的培養(yǎng)基體積→降低物料成本
•scale-X生物反應(yīng)器與鏈接的TFF相結(jié)合，可降低收獲液體積，省去澄清步驟
    →降低時(shí)間和物料成本
 
>>初步的工藝優(yōu)化和細(xì)胞均質(zhì)性評(píng)估證實(shí)了scale-X生物反應(yīng)器的高性能和可再現(xiàn)性，相比其它替代性填充床生物反應(yīng)器可獲得更高的產(chǎn)量
 
>>下一步的計(jì)劃將規(guī)模放大至結(jié)合了在線TFF的scale-X carbo和nitro生物反應(yīng)器的生產(chǎn)水平，以進(jìn)一步強(qiáng)化工藝。
  
>>與其它貼壁細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)不同的是，scale-X生物反應(yīng)器可實(shí)現(xiàn)工藝強(qiáng)化，從而顯著降低成本和時(shí)間。
   
scale-X carbo 生物反應(yīng)器 - 重塑臺(tái)式規(guī)模病毒生產(chǎn)  
NevoLine™上游平臺(tái)，用于病毒生產(chǎn)、濃縮和澄清
Changing the Biomanufacturing Paradigm - 改變生物藥品制造 · 創(chuàng)新模塊化的生產(chǎn)