蛋白質(zhì)組學(xué)助力腸道屏障功能障礙保護(hù)作用機(jī)制研究
發(fā)表期刊：Food & Function
發(fā)表時(shí)間：2020年8月19日
影響因子：4.171（中科院分區(qū)一區(qū),Top期刊）
合作客戶：江南大學(xué)
百趣生物提供服務(wù)：Label free非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)
1.研究背景
脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)是食物鏈中常見(jiàn)的真菌毒素之一，廣泛分布于谷物及受污染的食品和飼料中。有較多證據(jù)表明其對(duì)腸道穩(wěn)態(tài)的毒性有影響，特別是由緊密連接(TJ)、黏附連接(AJ)、縫隙連接和細(xì)胞橋粒維持的腸道屏障完整性。山奈酚（KAM）是一種廣泛存在于水果和蔬菜中的天然多酚抗氧化劑，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)KAM是防止DON暴露時(shí)Caco-2細(xì)胞單層屏障功能失調(diào)的最有效試劑。于是采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究了 KAM預(yù)處理對(duì)Caco-2細(xì)胞模型中由DON誘導(dǎo)的屏障功能障礙的保護(hù)作用，從而為降低DON毒性效應(yīng)的策略的發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。
2.材料和方法
- 主要技術(shù)：Label free非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)
- 樣本類型/分組：
Caco-2細(xì)胞：對(duì)照組，KAM組，DON組，KAM預(yù)處理組（KAM+DON組）
- 檢測(cè)平臺(tái)：Nano-LC-MS/MS
- 搜庫(kù)/定量軟件：MaxQuant
- 數(shù)據(jù)分析：R、STRING、SPSS
3.技術(shù)路線
4.研究結(jié)果
1. KAM預(yù)處理可改善DON暴露引起的屏障功能障礙
為了尋找預(yù)防或干預(yù)DON誘導(dǎo)的細(xì)胞屏障功能障礙的最佳候選化合物，作者選擇了橙皮素、槲皮素、山奈酚、白藜蘆醇、小檗堿、兒茶素、柚皮素和丁酸鈉等植物化學(xué)物質(zhì)，比較它們對(duì)抗DON誘導(dǎo)的屏障功能障礙的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在DON暴露時(shí)，KAM是唯一一個(gè)經(jīng)TEER評(píng)估對(duì)保護(hù)細(xì)胞屏障功能有顯著作用的物質(zhì)。與對(duì)照組相比，DON處理分別導(dǎo)致TEER和FD-4的通量顯著降低和增加，而經(jīng)KAM預(yù)處理組(KAM + DON)處理后則有明顯改善，表明KAM預(yù)處理有效地改善了DON對(duì)Caco-2細(xì)胞單層屏障功能的損傷，KAM對(duì)DON誘導(dǎo)的細(xì)胞屏障功能障礙起到保護(hù)作用。應(yīng)用Label free定量蛋白組來(lái)全面了解KAM260和DON對(duì)細(xì)胞屏障功能影響的潛在機(jī)制。
圖1 KAM和DON對(duì)Caco-2細(xì)胞模型的影響(A) TEER和(B) FD-4通量
2. 蛋白組學(xué)研究
與對(duì)照組相比，KAM組、DON組、KAM預(yù)處理組分別鑒定出670個(gè)、1295個(gè)和1052個(gè)差異表達(dá)蛋白（DEPs）（圖2），表明KAM和DON處理均顯著影響了Caco-2細(xì)胞中蛋白的表達(dá)。經(jīng)KAM預(yù)處理后，差異表達(dá)的下調(diào)和上調(diào)蛋白均顯著低于DON組，說(shuō)明DON影響的蛋白的表達(dá)在KAM預(yù)處理后被最小化或補(bǔ)償，這表明KAM對(duì)Caco-2細(xì)胞有潛在的有益作用，盡管DON仍然在KAM預(yù)處理組中起主導(dǎo)作用。
圖2 各對(duì)比組火山圖和DEPs統(tǒng)計(jì)
GO分析顯示三組DEPs均顯著(p<0.05)富集于細(xì)胞黏附分子結(jié)合(MF)、細(xì)胞連接(CC)和細(xì)胞連接組裝(BP)，表明KAM和DON均顯著影響細(xì)胞屏障功能（圖3）。KEGG分析顯示緊密連接、黏附連接和ECM相關(guān)通路在不同處理組中均富集，這證實(shí)了DON和KAM對(duì)細(xì)胞連接的影響。特別值得注意的是DON顯著影響了黏附連接的代謝通路，表明黏附連接(包括細(xì)胞-細(xì)胞粘附和細(xì)胞-基質(zhì)粘附)也是細(xì)胞連接的完整性所必需的（圖4）。進(jìn)一步分析KEGG富集的兩條代謝通路(緊密連接和黏附連接通路)，KAM預(yù)處理通過(guò)PKA和MAPK/ERK通路影響緊密連接和黏附連接蛋白的表達(dá)和組裝，從而改善對(duì)Caco-2細(xì)胞單層的屏障功能（圖5）。
圖3 GO富集分析
圖4 KEGG分析
圖5 緊密連接(A)和黏附連接(B)代謝通路及相關(guān)蛋白表達(dá)(以KAM + DON Vs DON為例)。
3.WB驗(yàn)證
為了驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，作者對(duì)參與緊密連接和黏附連接通路的相關(guān)蛋白進(jìn)行了western blot分析。結(jié)果表明，KAM預(yù)處理顯著提高了受DON不利影響的CLDN4，CDH16和 MAPK1蛋白質(zhì)的表達(dá)，與定量蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果一致。此外，P-VASP分析顯示，CON顯著降低P-VASP表達(dá)，而KAM預(yù)處理組則顯著增加其表達(dá)水平，表明 KAM預(yù)處理通過(guò)PKA提高VASP磷酸化水平起到保護(hù)作用。
圖6 WB分析
5.研究結(jié)論
KAM預(yù)處理可通過(guò)PKA和MAPK/ERK通路改善DON引起的腸道屏障功能障礙。基于生物活性植物化學(xué)物質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)方法以提高機(jī)體的免疫力可能是對(duì)抗真菌毒素對(duì)腸屏障功能的不利影響的有效策略。
6.文章延伸
百趣生物為本研究提供了Label free非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)分析服務(wù)。
Label free非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)是一種不依賴于同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)定量技術(shù)，該技術(shù)通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用對(duì)蛋白質(zhì)酶解肽段進(jìn)行檢測(cè)，分析大規(guī)模鑒定蛋白質(zhì)時(shí)所產(chǎn)生的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，對(duì)被檢測(cè)到的離子峰強(qiáng)度進(jìn)行積分，以積分面積進(jìn)行相對(duì)定量。
Label free非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)優(yōu)勢(shì)：
- 無(wú)需標(biāo)記，最大程度的保留樣本的真實(shí)性；
- 處理步驟簡(jiǎn)單，成本低；
- 不受標(biāo)簽數(shù)量的限制，多個(gè)樣本可以同時(shí)進(jìn)行蛋白定量分析。
