第89-101步

徠卡101

染色

從患者到病理學(xué)家，準(zhǔn)備樣本進(jìn)行診斷需要細(xì)心、經(jīng)驗(yàn)以及合理的流程。

徠卡特地為大家整理了取材、組織脫水、透明、浸蠟、包埋以及染色等（常規(guī)、特殊、IHC以及FISH）101步操作流程，幫助大家更有效、更簡(jiǎn)單地獲得實(shí)驗(yàn)方案，避免錯(cuò)誤的發(fā)生。
 

步驟八十九

使用高質(zhì)量切片

🙆正確：使用薄的，切片平整的切片，需將其在玻片上充分干燥。免疫組化和原味雜交宜使用帶電荷粘附載玻片。

🙅 錯(cuò)誤：不平整，貼合不平整的切片的染色不均勻，背景會(huì)被不同程度染色。

這張低質(zhì)量染色的切片（HPV）有凸起及背景染色。
 

步驟九十

確保最佳固定方式

🙆 正確：必須使用熟悉和恒定的固定條件（固定類(lèi)型，pH，溫度，時(shí)間）獲得優(yōu)質(zhì)固定，以達(dá)到最佳結(jié)果。

🙅 錯(cuò)誤：不穩(wěn)定的固定條件會(huì)導(dǎo)致樣本固定不足或固定過(guò)度，會(huì)使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定并且無(wú)法排查問(wèn)題原因。

A.在充分固定的扁桃體切片上進(jìn)行 Kappa輕鏈mRNA原位雜交反應(yīng)強(qiáng)烈，顏色銳麗。

B.在沒(méi)有充分固定的扁桃體切片上進(jìn)行 Kappa輕鏈mRNA原位雜交，反應(yīng)十分微弱。
 

步驟九十一

避免組織粘附

🙆 正確：避免在撈片設(shè)備中使用蛋白質(zhì)成分粘附劑（膠水，淀粉，明膠），特別是在使用帶電荷的載玻片的時(shí)候。

🙅 錯(cuò)誤：蛋白質(zhì)成分粘附劑會(huì)覆蓋在帶電荷載玻片的表面，造成組織粘附不均勻，使得原位雜交試劑從凸起切片的下方流出，導(dǎo)致染色不均一。

切片粘附不完全和折疊導(dǎo)致染色不均一（HPV）。
 

步驟九十二

優(yōu)化脫蠟和試劑應(yīng)用

🙆正確：在脫蠟和水化時(shí)，一定要保證試劑高效均一的分布在樣本表面。這樣才能保證染色均一，結(jié)果恒定。

🙅 錯(cuò)誤：脫蠟不完全會(huì)導(dǎo)致無(wú)法染色或染色不佳。前處理和染色過(guò)程中在樣本表面形成的氣泡也會(huì)產(chǎn)生問(wèn)題。

95°烤片形成氣泡導(dǎo)致染色不均一（HPV）。
 

步驟九十三

認(rèn)真挑選探針

🙆 正確：根據(jù)探針特異性和敏感性進(jìn)行選擇。

🙅 錯(cuò)誤：“我們只根據(jù)價(jià)格購(gòu)買(mǎi)探針。”

兩張扁桃體切片都使用原位雜交對(duì)kapa輕鏈mMA進(jìn)行染色(BcIP/NBT)。兩張切片使用寡核苷酸探針來(lái)源不同。切片A顯色強(qiáng)烈而切片B顯色不足并只有部分細(xì)胞被染色。
 

步驟九十四

閱讀參數(shù)表

🙆 正確：了解你的探針。一定要檢查參數(shù)表，來(lái)確認(rèn)當(dāng)前的實(shí)驗(yàn)方法是否適用于特定的探針。仔細(xì)控制溫度和時(shí)間，提供最優(yōu)化的雜交條件。即該條件下，探針和目標(biāo)的特異結(jié)合最大化。

🙅 錯(cuò)誤：不了解探針數(shù)據(jù)表：“我們用標(biāo)準(zhǔn)流程就行”。

兩張濕疣切片都使用原位雜交對(duì)HPV進(jìn)行染色。兩張切片使用同樣的DNA探針，但是雜交條件不同。切片A顯色強(qiáng)烈而切片B顯色失敗。
 

步驟九十五

優(yōu)化預(yù)處理?xiàng)l件

🙆 正確：選擇合適的預(yù)處理和優(yōu)化條件。取決于固定條件和組織類(lèi)型。

🙅 錯(cuò)誤：對(duì)不同的探針使用同樣的酶預(yù)處理?xiàng)l，有時(shí)會(huì)導(dǎo)致染色體結(jié)果不佳。

這張切片使用 Poly d（T）陽(yáng)性對(duì)照探針進(jìn)行染色。染色結(jié)果表明這張切片被蛋白酶K過(guò)度消化。不但造成粘液上皮細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)缺失，而且背景染色過(guò)重。
 

步驟九十六

仔細(xì)處理組織

🙆正確：仔細(xì)處理組織樣本并及時(shí)固定可以限制由內(nèi)源性RNA酶導(dǎo)致的RNA損失。

🙅 錯(cuò)誤：處理組織時(shí)粗心大意，固定不及時(shí)，將會(huì)促進(jìn)由內(nèi)源性RNA酶導(dǎo)致更多的RNA損失。

扁桃體組織用 Poly d（T）陽(yáng)性對(duì)照探針進(jìn)行染色，由于RNA酶降解RNA導(dǎo)致的染色不足。
 

步驟九十七

使用合適的顯色系統(tǒng)

🙆正確：選擇靈敏的顯色系統(tǒng)，優(yōu)化孵育條件。

🙅 錯(cuò)誤：即使探針已與目標(biāo)結(jié)合，顯色系統(tǒng)靈敏度不夠也可能導(dǎo)致染色不足，甚至陰性結(jié)果。

該扁桃體切片染色不足是由于顯色系統(tǒng)靈敏度不夠造成的。Lambda輕鏈的原位雜交使用了非聚合物的顯色系統(tǒng)。

 

步驟九十八

避免試劑蒸發(fā)

🙆正確：在孵育過(guò)程中應(yīng)避免探針和其他試劑的蒸發(fā)。由于需要長(zhǎng)時(shí)間孵育，試劑干結(jié)是一個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題。必須使用高質(zhì)量?jī)x器。

🙅 錯(cuò)誤：如果探針和其他試劑干結(jié)（通常在邊緣處），干結(jié)處將形成過(guò)重和非特異染色。

該扁桃體切片用原位雜交對(duì) kappa輕鏈進(jìn)行顯色。切片在甲酰胺雜交過(guò)程中變得過(guò)干，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定，產(chǎn)生非特異性反應(yīng)。
 

步驟九十九

清洗步驟標(biāo)準(zhǔn)化

🙆正確：將整個(gè)流程的清洗步驟標(biāo)準(zhǔn)化（包括：持續(xù)時(shí)間，清洗液體積，攪動(dòng)方式），如此可保證穩(wěn)定的試驗(yàn)結(jié)果。

🙅 錯(cuò)誤：同一探針在不同批次和日期的結(jié)果差異很大，這可能是由于操作者在清洗步驟上不夠標(biāo)準(zhǔn)造成的。

這2張扁桃體切片用原位雜交對(duì) kappa輕鏈進(jìn)行顯色。切片A顯示過(guò)重的背景染色，而切片B背景清晰，這有可能就是由于切片A的清洗不足而造成的。
 

步驟一百

使用合適對(duì)照

🙆正確：每一批次都使用合適的對(duì)照。對(duì)照應(yīng)包含陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照為已知陽(yáng)性的組織，陰性對(duì)照是使用非特異探針的檢測(cè)組織。

🙅 錯(cuò)誤：“我們只在試驗(yàn)出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)才會(huì)使用質(zhì)控片。如果每一輪實(shí)驗(yàn)都做質(zhì)控片的話(huà),大家沒(méi)有耐心去看的。”

這張切片使用 Poly d(T)陽(yáng)性對(duì)照探針進(jìn)行染色。精確的染色表明該組織固定良好，RNA序列保存完整。

步驟一百零一

認(rèn)真評(píng)估結(jié)果

🙆正確：評(píng)價(jià)染色后的切片和對(duì)照時(shí)，知道觀察什么、觀察哪里。任何一個(gè)承擔(dān)原位雜交的工作人員都應(yīng)該對(duì)該技術(shù)的原理有基本的了解，應(yīng)知道哪里能找到陽(yáng)性染色。

🙅 錯(cuò)誤：無(wú)論在切片何處發(fā)現(xiàn)染色，都表明該次染色是成功的。

除了添加探針外，該扁桃體陰性對(duì)照切片完成了所有的原位雜交步驟。它表現(xiàn)出了鐵血黃素，該物質(zhì)天然即為棕色并可與DAB結(jié)合加深顯色，這并非陽(yáng)性染色。

本期是我們徠卡101樣本診斷流程小貼士的最后一次分享，感謝大家一直以來(lái)的關(guān)注，我們希望通過(guò)這段時(shí)間的閱讀，傳遞學(xué)術(shù)知識(shí)，并能夠解決困擾大家的問(wèn)題。未來(lái)我們還將帶給大家更多的精彩！