我們之前在Pall iCELLis®固定床生物反應(yīng)器中，以小規(guī)模和商品化規(guī)模，進(jìn)行了病毒載體（慢病毒、腺病毒以及腺相關(guān)病毒）的生產(chǎn)。最近，一家名為Univercells的比利時(shí)公司推出了一種新型固定床生物反應(yīng)器，其具有相同的細(xì)胞生長(zhǎng)表面基質(zhì)材料，但固定床結(jié)構(gòu)與iCELLis生物反應(yīng)器所使用的結(jié)構(gòu)不同。我們嘗試對(duì)這種新型scale-X hydro生物反應(yīng)器（2.4m2）和iCELLis Nano系統(tǒng)（2.67m2）進(jìn)行一對(duì)一比較，以了解這種差別對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及慢病毒載體或腺病毒載體產(chǎn)量的影響。實(shí)驗(yàn)運(yùn)行使用在iCELLisNano生物反應(yīng)器中針對(duì)病毒載體生產(chǎn)而優(yōu)化的參數(shù)進(jìn)行。細(xì)胞生長(zhǎng)通過(guò)細(xì)胞核計(jì)數(shù)以及跟蹤葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生來(lái)監(jiān)測(cè)。在兩種生物反應(yīng)器系統(tǒng)中，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，且發(fā)現(xiàn)scale-X生物反應(yīng)器中細(xì)胞分布相當(dāng)均勻。結(jié)果證實(shí)，在慢病毒載體和腺病毒載體生產(chǎn)中，Univercells的scale-X生物反應(yīng)器至少可獲得同等效率，甚至更優(yōu)化�；�于這些結(jié)果，用于iCELLis生物反應(yīng)器中病毒載體生產(chǎn)的相同程序和參數(shù)也可成功用于scale-X生物反應(yīng)器系統(tǒng)中的生產(chǎn)。
 
簡(jiǎn)介
用于基因治療的病毒載體仍主要以貼壁細(xì)胞生產(chǎn)。標(biāo)準(zhǔn)的小規(guī)模生產(chǎn)依賴于不同的培養(yǎng)瓶方法，而規(guī)模放大選擇有，例如Cell Factories（細(xì)胞工廠，ThermoFisher Scientific）或Hyperstacks（Corning）。但是，這些方法需要大量的人工操作，可能需要開放式連接，且不能監(jiān)測(cè)或控制pH、溶氧等。所以，需要用于貼壁細(xì)胞的大規(guī)模、可拋棄型生物反應(yīng)器。ATMI/Pall在十多年前推出了iCELLis固定床生物反應(yīng)器。iCELLis Nano生物反應(yīng)器的三維固定床由數(shù)百根13.9 cm2的小尺寸聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（PET）纖維（“載體”）組成，其裝填在生物反應(yīng)器內(nèi)。iCELLis生物反應(yīng)器提供高（144g/L）和低（96g/L）兩種壓縮結(jié)構(gòu)。iCELLis Nano生物反應(yīng)器的培養(yǎng)面積可達(dá)4.2m2，對(duì)于小規(guī)模批次來(lái)說(shuō)，是非常有用的工具，但其主要用于工藝開發(fā)和優(yōu)化。iCELLis 500是商品化規(guī)模系統(tǒng)，根據(jù)固定床高度和載體壓縮程度，其培養(yǎng)面積范圍為66 – 500m2。我們是最早將iCELLis技術(shù)用于基于HEK293(T)貼壁系統(tǒng)，以進(jìn)行腺病毒、慢病毒和腺相關(guān)病毒（AAV）載體生產(chǎn)工藝的團(tuán)隊(duì)之一。工藝開發(fā)在iCELLis Nano生物反應(yīng)器上進(jìn)行，然后工藝規(guī)模放大至iCELLis 500規(guī)模，目前，我們已在iCELLis 500中生產(chǎn)了用于臨床試驗(yàn)的病毒載體物料。我們每個(gè)批次可生產(chǎn)>1x10^16腺病毒顆粒。其它團(tuán)隊(duì)也發(fā)現(xiàn)iCELLis生物反應(yīng)器可有效用于逆轉(zhuǎn)錄病毒、AAV、狂犬、甲肝以及基孔肯雅疫苗的生產(chǎn)，或以昆蟲細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白。iCELLis 500生物反應(yīng)器是一種符合GMP要求、完全可拋棄且可控的系統(tǒng)，并具有灌流能力。系統(tǒng)支持貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)和高滴度生產(chǎn)。
 
基于對(duì)iCELLis系統(tǒng)的專業(yè)知識(shí)，我們自然對(duì)Univercells新近推出的貼壁生物反應(yīng)器深感興趣。Univercells的scale-X生物反應(yīng)器系統(tǒng)是一種自動(dòng)化及一次性使用固定床生物反應(yīng)器，其培養(yǎng)面積范圍為2.4m2（商品名為hydro）至600m2（nitro）及以上。Univercells附有10-30m2“中型尺寸”scale-X carbo生物反應(yīng)器系統(tǒng)。到2020年，所有的scale-X生物反應(yīng)器可用于GMP生產(chǎn)。系統(tǒng)適合，例如，體外使用，特別是當(dāng)產(chǎn)量要求低于直接將病毒載體注入患者體內(nèi)所需要求時(shí)。系統(tǒng)的固定床材料與iCELLis固定床相同，但是結(jié)構(gòu)不同。iCELLis固定床使用微載體相對(duì)隨機(jī)的填充，而在scale-X生物反應(yīng)器中，固定床是5cm2寬度的剛性聚丙烯篩網(wǎng)條帶和非編織親水性聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（PET）織物交替螺旋管式組成的雙層的均一結(jié)構(gòu)，層間由間隔網(wǎng)隔開。這種結(jié)構(gòu)可在整個(gè)固定床中實(shí)現(xiàn)更好、更均勻的細(xì)胞分布。除了病毒載體生產(chǎn)外，scale-X生物反應(yīng)器系統(tǒng)也可實(shí)現(xiàn)連續(xù)的在線濃度，因?yàn)橄到y(tǒng)可選擇內(nèi)置中空纖維切向流過(guò)濾模塊。通過(guò)將scale-X生物反應(yīng)器與NevoLine微型工廠結(jié)合，使用用于生物反應(yīng)器和在線下游處理的鏈?zhǔn)椒忾]柜體，可降低GMP設(shè)施要求。我們測(cè)試將這種新型scale-X hydro生物反應(yīng)器系統(tǒng)用于慢病毒和腺病毒載體生產(chǎn)，以確定不同的膜基質(zhì)裝置是否會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)或病毒載體產(chǎn)量，并將系統(tǒng)與iCELLis生物反應(yīng)器進(jìn)行了比較。兩種生物反應(yīng)器系統(tǒng)使用此前在iCELLis生物反應(yīng)器上優(yōu)化的相同參數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在兩種生物反應(yīng)器中，細(xì)胞生長(zhǎng)相似。Scale-X hydro生物反應(yīng)器中的產(chǎn)量至少與iCELLis Nano系統(tǒng)中的產(chǎn)量相當(dāng)。
  
材料和方法
  
細(xì)胞系和培養(yǎng)基
 
293T（ATCC，Manassas，VA）和HEK293（ATCC）細(xì)胞培養(yǎng)在添加了10%（v/v）胎牛血清（FBS，Gibco）以及50-100 U/mL青霉素、50-100μg/mL鏈霉素（Gibco）和4mML-谷氨酰胺（Gibco）的高-或低-葡萄糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco，Paisley，United Kingdom/Sigma-Aldrich，Irvine，United Kingdom）中進(jìn)行，用于慢病毒載體和腺病毒載體生產(chǎn)。此外，在慢病毒載體生產(chǎn)中，轉(zhuǎn)染后（PT）培養(yǎng)基補(bǔ)充1x非基本氨基酸（Gibco）、1mM 丙酮酸鈉（Gibco）以及1:500 CD-脂質(zhì)添加物（Gibco）。FBS包含在生物反應(yīng)器接種前、細(xì)胞擴(kuò)增時(shí)的起始培養(yǎng)基中以及直到轉(zhuǎn)染后24h的生物反應(yīng)器運(yùn)行中，之后的運(yùn)行不添加FBS。接種密度7,000 – 9,000 cells/cm2。接種前，所有細(xì)胞培養(yǎng)在+37℃、5%CO2濕化環(huán)境的T型瓶中。
 
用于慢病毒載體感染性滴度分析的HeLa細(xì)胞（ATCC）培養(yǎng)在DMEM-10%FBS（Gibco）-50U/mL青霉素和50μg/mL鏈霉素（Gibco）中。轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)不含F(xiàn)BS。
 
iCELLis Nano和scale-Xhydro生物反應(yīng)器中的慢病毒載體生產(chǎn)
 
總共進(jìn)行4個(gè)scale-X生物反應(yīng)器運(yùn)行。在3個(gè)運(yùn)行中，生產(chǎn)慢病毒載體，另1個(gè)運(yùn)行中，在轉(zhuǎn)染前，按Univercells提供的指導(dǎo)，對(duì)生物反應(yīng)器進(jìn)行拆解，以分析固定床不同區(qū)域的細(xì)胞密度。一個(gè)iCELLis Nano生物反應(yīng)器作為對(duì)照，平行運(yùn)行。
 
iCELLis Nano中的慢病毒載體生產(chǎn)使用2.67m2低壓縮固定床生物反應(yīng)器（Pall Life Sciences，Hoegaarden，Belgium）。在scale-X生物反應(yīng)器運(yùn)行中，使用Univercells（Gosselies，Belgium）的2.4m2 scale-X hydro生物反應(yīng)器。運(yùn)行按此前描述進(jìn)行，使用灌流維持目標(biāo)0.5g/L葡萄糖。葡萄糖和乳酸每天檢測(cè)1次或2次（Cedex-Bio，Roche，Mannheim，Germany）。接種后的1h，生物反應(yīng)器培養(yǎng)基取樣，對(duì)非貼壁的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。按此前報(bào)導(dǎo)，在第1-4天，對(duì)iCELLis Nano生物反應(yīng)器中貼附到載體的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞核計(jì)數(shù)。在scale-X hydro生物反應(yīng)器中，膜層間有采樣條（與iCELLis Nano生物反應(yīng)器中的載體尺寸大致相同），可與iCELLis Nano系統(tǒng)相似地進(jìn)行取樣和細(xì)胞核計(jì)數(shù)。對(duì)于每個(gè)細(xì)胞核計(jì)數(shù)，使用無(wú)菌鑷子取兩根采樣條。此外，1個(gè)scale-X生物反應(yīng)器固定床拆解，對(duì)固定床頂部（距離頂部邊緣1cm）、中部和底物（距離底部邊緣1cm）、兩個(gè)膜層以及固定床的外、中和內(nèi)表面進(jìn)行細(xì)胞核計(jì)數(shù)（圖1）。對(duì)于細(xì)胞核計(jì)數(shù)，從膜上裁1cm2小片。
 
在所有運(yùn)行中，以1:1的DNA：PEIpro比例和200 ng/cm2質(zhì)粒（PlasmidFactory Bielefeld，Germany），使用PEIpro（Polyplus-transfection，Illkirch，France）–介導(dǎo)轉(zhuǎn)染，生產(chǎn)三代LV-GFP。轉(zhuǎn)染按此前描述進(jìn)行。
 
開始收獲前，進(jìn)行完整的培養(yǎng)基置換，轉(zhuǎn)染后24– 72h，在室溫條件下，通過(guò)收集灌流培養(yǎng)基，收獲病毒載體。運(yùn)行結(jié)束時(shí)，生物反應(yīng)器排放至相應(yīng)的收集袋中。
 
iCELLis Nano和scale-Xhydro生物反應(yīng)器中的腺病毒載體生產(chǎn)
 
總共進(jìn)行了兩個(gè)生物反應(yīng)器運(yùn)行，一個(gè)使用scale-X生物反應(yīng)器，一個(gè)使用iCELLis Nano系統(tǒng)，以比較腺病毒載體生產(chǎn)的差異。除與慢病毒運(yùn)行一樣，通過(guò)灌流控制目標(biāo)0.5g/L葡萄糖外，運(yùn)行按此前描述進(jìn)行。細(xì)胞接種密度為7,000 cells/cm2,。與慢病毒運(yùn)行相似地，葡萄糖和乳酸每天檢測(cè)2次（Cedex-Bio），第1-4天進(jìn)行細(xì)胞核計(jì)數(shù)。感染按之前描述進(jìn)行，兩個(gè)生物反應(yīng)器使用相同的腺病毒載體（Ad-GFP）數(shù)量（平均感染復(fù)數(shù)值為75）。感染后68h，使用基于去垢劑的裂解方法進(jìn)行細(xì)胞裂解。收獲物料使用0.027 m2深層濾器（Millipore，Billerica，MA）澄清。

  圖1. 拆解的Univercells scale-X hydro生物反應(yīng)器的細(xì)胞技術(shù)。從頂部（a）和側(cè)面（b）觀察的scale-X 生物反應(yīng)器示意圖。淡灰和深灰點(diǎn)指示用于細(xì)胞密度分析的取樣點(diǎn)。淡灰=內(nèi)側(cè)膜的取樣，深灰=外側(cè)膜層的取樣。對(duì)于細(xì)胞密度分析，對(duì)固定床頂部、中部和底物、卷膜的外表面、中部以及內(nèi)表面進(jìn)行細(xì)胞核計(jì)數(shù)。示意圖下方表格中所示為細(xì)胞密度（cells/cm2）。

分析
 
慢病毒載體的感染性滴度（轉(zhuǎn)導(dǎo)單位[TU]/mL）使用基于定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）的方法確定。慢病毒載體顆粒（vp）滴度通過(guò)將p24酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA；PerkinElmer，Waltham，MA）的pg/mL結(jié)果轉(zhuǎn)換為vp/mL來(lái)分析，假定p24的1pg為12,500慢病毒顆粒。腺病毒載體顆粒滴度使用高效液相色譜（HPLC）分析。
 
結(jié)果和討論
 
ATMI/Pall大約在10年前推出了第一款全整合式、可拋棄型固定床生物反應(yīng)器iCELLis。此外，市面上也有一些其它公司開發(fā)的貼壁生物反應(yīng)器，如Celligen（NewBrunswick Scientific）、CellCube（Costar）、裝填床生物反應(yīng)器（BioBLU，Eppendorf）以及基于微載體的生物反應(yīng)器。在最近的創(chuàng)新產(chǎn)品中，還包括Univercells生產(chǎn)的scale-X生物反應(yīng)器，該公司由JoseCastillo聯(lián)合創(chuàng)立，他也是iCELLis系統(tǒng)的發(fā)明者之一。我們的團(tuán)隊(duì)對(duì)于使用iCELLis生物反應(yīng)器進(jìn)行病毒載體生產(chǎn)具有豐富的經(jīng)驗(yàn)。由于iCELLis和scale-X生物反應(yīng)器中，用于細(xì)胞貼附的膜采用相同的材質(zhì)，我們假設(shè)在iCELLis生物反應(yīng)器中優(yōu)化和使用的參數(shù)可相當(dāng)簡(jiǎn)單地轉(zhuǎn)移到scale-X生物反應(yīng)器。為測(cè)試這種假設(shè)，我們比較了scale-X生物反應(yīng)器和iCELLis Nano系統(tǒng)中的細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞分布、培養(yǎng)基消耗以及慢病毒和腺病毒載體生產(chǎn)。
 
細(xì)胞分布 
 
我們之前比較了iCELLis Nano生物反應(yīng)器高壓縮固定床（4m2）和低壓縮固定床（2.67m2）中的細(xì)胞分布，發(fā)現(xiàn)在低壓縮中，細(xì)胞分布更加均衡。在高壓縮固定床中，細(xì)胞分布有較大的差異，取決于計(jì)數(shù)的細(xì)胞來(lái)自哪一層（相比頂部，底部的細(xì)胞量要高3到4倍）。盡管在低壓縮固定床中，差異性較小，我們還是注意到，相比底部，低壓縮床中部的細(xì)胞量要高2到3倍。對(duì)拆卸的scale-X生物反應(yīng)器進(jìn)行了細(xì)胞密度分析，以了解固定床不同部分中的細(xì)胞分布（圖1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)固定床中，細(xì)胞分布相比均衡（圖1）。但是，當(dāng)垂直或水平分析時(shí)，固定床中部的細(xì)胞密度要高約2倍，這與低壓縮iCELLis生物反應(yīng)器中的結(jié)果較為接近。當(dāng)對(duì)雙層膜的外膜和內(nèi)膜進(jìn)行細(xì)胞密度分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)差異很小。這可能是由于scale-X生物反應(yīng)器固定床的卷式膜樣結(jié)構(gòu)形成了批次間細(xì)胞密度以及細(xì)胞生長(zhǎng)更低的變異性。相比scale-X生物反應(yīng)器，iCELLis生物反應(yīng)器中，特別是在高壓縮固定床中，細(xì)胞密度更高的變異性，可能是由于載體相對(duì)隨機(jī)且緊實(shí)的填充。所以，在iCELLis生物反應(yīng)器中，由于存在一些低致密和高致密區(qū)域，每個(gè)反應(yīng)器之間總是有差異。
  
此外，在拆解前，對(duì)拆解的生物反應(yīng)器的采樣條進(jìn)行取樣，計(jì)算密度為~1.1x10^5cells/cm2，接近膜頂-中部的密度（1.2x10^5±0.4x10^4）。所以，可見scale-X生物反應(yīng)器中的采樣條具有代表性，可用于評(píng)估細(xì)胞密度。
 
細(xì)胞生長(zhǎng)
 
對(duì)于iCELLis Nano系統(tǒng)，我們優(yōu)化了接種使用的細(xì)胞密度，所以，在第0天，對(duì)照的Nano系統(tǒng)以7,000 293T cells/cm2的密度接種。對(duì)于scale-X生物反應(yīng)器，使用兩種不同接種密度，7,000 cells/cm2（scale-X生物反應(yīng)器運(yùn)行1-3）以及9,000 cells/cm2（scale-X生物反應(yīng)器運(yùn)行4）。在兩種生物反應(yīng)器中，細(xì)胞均可很快貼附至PET內(nèi)層，因?yàn)榻臃N后1h，生物反應(yīng)器的培養(yǎng)基取樣中，未發(fā)現(xiàn)游離細(xì)胞。感染時(shí)的目標(biāo)細(xì)胞密度為150,000-200,000 cells/cm2，且通常，在iCELLis Nano運(yùn)行中，該密度可在4天內(nèi)達(dá)到。為監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)，iCELLis Nano和scale-X生物反應(yīng)器可在層流罩內(nèi)打開，使用無(wú)菌鑷子從生物反應(yīng)器夾取載體（Nano 生物反應(yīng)器）或采樣條（scale-X 生物反應(yīng)器）。重要的是，在scale-X生物反應(yīng)器系統(tǒng)更大尺寸的固定床中，也可以通過(guò)采樣條取樣，而iCELLis 500生物反應(yīng)器中的載體不能取樣。
 
計(jì)算在第1-4天（轉(zhuǎn)染前）從生物反應(yīng)器固定床頂部取樣的載體/采樣條的細(xì)胞核，并轉(zhuǎn)換為細(xì)胞密度（圖2a）。scale-X生物反應(yīng)器運(yùn)行3中達(dá)到目標(biāo)細(xì)胞密度，scale-X生物反應(yīng)器運(yùn)行1和2接近達(dá)到目標(biāo)細(xì)胞密度。scale-X 運(yùn)行4中更高的接種細(xì)胞密度導(dǎo)致轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度過(guò)高�？赡苁怯捎谡�合固定床中不均勻的細(xì)胞分布，對(duì)照Nano運(yùn)行也超過(guò)了目標(biāo)細(xì)胞密度。
 
葡萄糖和培養(yǎng)基消耗
 
在所有運(yùn)行中，使用灌流提供新鮮培養(yǎng)基。目標(biāo)是通過(guò)使用高-葡萄糖DMEM作為灌流培養(yǎng)基，而維持生物反應(yīng)器中0.5g/L的葡萄糖濃度。為調(diào)節(jié)灌流速率，每天從生物反應(yīng)器培養(yǎng)基取樣監(jiān)測(cè)葡萄糖和乳酸濃度（圖2b、c）。盡管在scale-X生物反應(yīng)器運(yùn)行1和2中，培養(yǎng)基和葡萄糖消耗低于標(biāo)準(zhǔn)iCELLis Nano運(yùn)行，在運(yùn)行3和4中，葡萄糖和培養(yǎng)基消耗在iCELLis Nano范圍內(nèi)（圖3）。值得考慮的是，在運(yùn)行4中，相比其它運(yùn)行，接種使用了更高的cells/cm2值。當(dāng)計(jì)算感染前數(shù)值時(shí)，相比對(duì)照或標(biāo)準(zhǔn)iCELLis Nano運(yùn)行，所有scale-X運(yùn)行中的細(xì)胞特異性葡萄糖消耗最多可降低4倍（圖3i）。如果考慮到細(xì)胞密度在轉(zhuǎn)染后不發(fā)生變化，則可以評(píng)估收獲前的細(xì)胞特異性葡萄糖消耗（圖3j）。相比標(biāo)準(zhǔn)iCELLis Nano運(yùn)行，scale-X生物反應(yīng)器運(yùn)行中的細(xì)胞特異性葡萄糖消耗低達(dá)3倍。但是，這必須考慮到兩種生物反應(yīng)器類型中，整個(gè)固定床內(nèi)不同的細(xì)胞密度，而且細(xì)胞特異性葡萄糖消耗僅根據(jù)采取的頂部載體進(jìn)行計(jì)算。這反應(yīng)了scale-X生物反應(yīng)器中更低的培養(yǎng)基/葡萄糖消耗。特別是，如果在24hPT前，灌流速率降低，成本可進(jìn)一步降低，因?yàn)樾枰�的昂貴FBS的體積更�。ㄔ谖覀兊姆桨钢�，從24h PT開始，F(xiàn)BS不用于灌流培養(yǎng)基）。此外，灌流中更低的培養(yǎng)基消耗可降低收獲液體積，這有益于下游工藝處理。Scale-X生物反應(yīng)器中更低的葡萄糖/培養(yǎng)基消耗的原因只能推測(cè)，但部分可能是由于scale-X中更加均勻的固定床結(jié)構(gòu)。而且，在scale-X生物反應(yīng)器中，循環(huán)的培養(yǎng)基可能可更加均等地達(dá)到細(xì)胞。
 
基于iCELLis Nano和scale-X中的總培養(yǎng)基消耗，如果直接放大至含有333m2固定床的iCELLis 500，灌流總共將使用大概~150L培養(yǎng)基，而含有600m2固定床的scale-X nitro中消耗的體積將為670 至940L。
  圖2. scale-X hydro生物反應(yīng)器和iCELLis Nano生物反應(yīng)器運(yùn)行中的細(xì)胞密度以及葡萄糖和乳酸濃度。（a）第0-4天，計(jì)算的固定床頂部的細(xì)胞密度（cells/cm2）；第0-7天，（b）葡萄糖和（c）乳酸濃度。對(duì)照Nano = Nano運(yùn)行，運(yùn)行與scale-X生物反應(yīng)器運(yùn)行一起進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)Nano = 5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)Nano運(yùn)行的平均值。Scale-X 1-4 = scale-X生物反應(yīng)器運(yùn)行1-4。
  圖3. scale-X hydro 生物反應(yīng)器和iCELLis Nano生物反應(yīng)器運(yùn)行中，培養(yǎng)基和葡萄糖消耗的散點(diǎn)印跡圖。（a、b）轉(zhuǎn)染前的培養(yǎng)基消耗，以mL（a）和μL/cm2（b）為單位；（c、d）收獲前運(yùn)行中總培養(yǎng)基消耗，以mL（c）和μL/cm2（d）為單位；（e、f）轉(zhuǎn)染前的葡萄糖消耗，以g（e）和mg/cm2（f）為單位；（g、h）收獲前的總葡萄糖消耗，以g（g）和mg/cm2（h）為單位；（i、j）轉(zhuǎn)染前（i）和收獲前（j）的細(xì)胞特異性葡萄糖消耗，以pmol/cell/day為單位，考慮轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞密度不增加。標(biāo)準(zhǔn)Nano=5個(gè)用于慢病毒載體生產(chǎn)的iCELLis Nano運(yùn)行，對(duì)照Nano=與scale-X生物反應(yīng)器運(yùn)行一同進(jìn)行的運(yùn)行。Scale-X 1-4=scale-X生物反應(yīng)器運(yùn)行1-4，其中，運(yùn)行1未轉(zhuǎn)染，而在第4天停止運(yùn)行并拆解固定床。對(duì)于每個(gè)運(yùn)行，標(biāo)準(zhǔn)Nano運(yùn)行標(biāo)識(shí)為獨(dú)立的點(diǎn)；此外，顯示SEM和中位數(shù)。SEM，標(biāo)準(zhǔn)平均誤差。
 
在iCELLis Nano和scale-X生物反應(yīng)器中的慢病毒載體產(chǎn)量
 
在scale-X生物反應(yīng)器和對(duì)照/標(biāo)準(zhǔn)Nano運(yùn)行中，以p24 ELISA分析的病毒顆粒滴度以及以基于qPCR的方法分析計(jì)算的感染性滴度均在相同的范圍內(nèi)（圖4a-d）。在獨(dú)立的分析中分析的感染性滴度不能可靠地相互比較，但是，如滴度檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行，則可以進(jìn)行比較。對(duì)照Nano和scale-X生物反應(yīng)器運(yùn)行3和4同時(shí)進(jìn)行滴度檢測(cè)，在這些運(yùn)行中，scale-X生物反應(yīng)器中的生產(chǎn)的TU幾乎是iCELLis Nano運(yùn)行的兩倍多。由于scale-X生物反應(yīng)器中的固定床尺寸相比iCELLis Nano小，所有每cm2的TU差異更大（圖4d）。在所有的運(yùn)行中，VP產(chǎn)量彼此接近（圖4a、b），所以，基于這些運(yùn)行，scale-X生物反應(yīng)器運(yùn)行3中的vp/TU比（vp/TU：652）好于iCELLis Nano（vp/TU：1339）生物反應(yīng)器。但是，在轉(zhuǎn)染過(guò)程中，按細(xì)胞核計(jì)數(shù)，iCELLis Nano生物反應(yīng)器中的細(xì)胞密度約為目標(biāo)的兩倍。由于接種的細(xì)胞量與標(biāo)準(zhǔn)運(yùn)行相同，所以可能的解釋是固定床中細(xì)胞的不均勻分布，其可能降低了轉(zhuǎn)染效率，進(jìn)而影響產(chǎn)量。如scale-X生物反應(yīng)器運(yùn)行4當(dāng)中所見，至少接種9,000 cells/cm2更高的細(xì)胞密度時(shí)，不會(huì)提高產(chǎn)量，7,000 cells/cm2似乎是scale-X生物反應(yīng)器中的最佳接種密度。由于所有scale-X生物反應(yīng)器運(yùn)行中的產(chǎn)量與iCELLis Nano（對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)運(yùn)行）相比，至少相似或甚至更高，所以iCELLis Nano生物反應(yīng)器中使用的參數(shù)可相對(duì)簡(jiǎn)單地轉(zhuǎn)移到scale-X生物反應(yīng)器，而不需要針對(duì)另一種固定床進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化。但是，優(yōu)化后可能可進(jìn)一步提高滴度。
 
我們之前注意到，相比低壓縮的固定床，在高壓縮固定床進(jìn)行生產(chǎn)時(shí)，每cm2的慢病毒載體產(chǎn)量要低。在2.67m2低壓縮固定床的iCELLis Nano生物反應(yīng)器生產(chǎn)的病毒載體量與4m2高壓縮固定床中的產(chǎn)量相同。此外，使用低壓縮固定床時(shí)，培養(yǎng)基消耗更低，且更容易預(yù)測(cè)。所以，使用當(dāng)前的iCELLis 500，理論上可達(dá)到1-2x10^12TU（使用qPCR方法，在HeLa細(xì)胞中進(jìn)行滴度檢測(cè)）或1-3x10^15VP（病毒顆粒）的總產(chǎn)量。目前，最大的低壓縮iCELLis固定床尺寸為333m2。對(duì)于scale-X生物反應(yīng)器，其只提供一種壓縮。根據(jù)scale-X生物反應(yīng)器生產(chǎn)商的信息，其可提供的最大固定床尺寸至少為600m2。所以，如果使用scale-X生物反應(yīng)器系統(tǒng)，進(jìn)行直接規(guī)模放大，iCELLis生物反應(yīng)器中生產(chǎn)的病毒載體量至少可以翻倍，甚至翻三倍。但是，我們發(fā)現(xiàn)，盡管iCELLis生物反應(yīng)器系統(tǒng)應(yīng)該可以直接規(guī)模放大，但是出于未知的原因，當(dāng)慢病毒載體生產(chǎn)從iCELLis Nano規(guī)模放大到iCELLis 500規(guī)模（使用100或333m2）時(shí)，相比小規(guī)模，每m2生產(chǎn)的病毒載體更多，而在大規(guī)模中，每m2消耗的培養(yǎng)基更少。所以，如果大規(guī)模中的產(chǎn)量提升與生物反應(yīng)器固定床的組成無(wú)關(guān)，而與其它大規(guī)模工藝參數(shù)相關(guān)，如無(wú)抗生素生產(chǎn)，而相同的情況也發(fā)生在大規(guī)模scale-X生物反應(yīng)器中，則scale-X nitro 生物反應(yīng)器中可能可達(dá)到超于>1x10^13 TU（在我們的HeLa細(xì)胞中進(jìn)行滴度檢測(cè)）或超于 >1x10^16vp。
 
由于iCELLis和scale-X生物反應(yīng)器均旨在貼壁使用，所有其可放大性確實(shí)有限。使用懸浮生物反應(yīng)器時(shí)，可放大性限制較少，例如，使用2,000L懸浮生物反應(yīng)器可極大地提高產(chǎn)量。目前，很多慢病毒載體批次，甚至是用于臨床試驗(yàn)時(shí)，仍使用細(xì)胞工廠、3L攪拌罐或僅達(dá)50L的波浪式生物反應(yīng)器或攪拌罐進(jìn)行生產(chǎn)。但是，僅有極少數(shù)的病毒載體生產(chǎn)商報(bào)導(dǎo)了更大的懸浮生物反應(yīng)器的使用。在貼壁生物反應(yīng)器中，如iCELLis和scale-X生物反應(yīng)器系統(tǒng)，可通過(guò)灌流，簡(jiǎn)單地提供新鮮的培養(yǎng)，并去除用過(guò)的培養(yǎng)基。由于慢病毒載體生產(chǎn)后進(jìn)入培養(yǎng)基，灌流可以簡(jiǎn)單地收集病毒載體，并實(shí)現(xiàn)連續(xù)的下游工藝處理。盡管懸浮生物反應(yīng)器有灌流選項(xiàng)，懸浮中的灌流仍處于其早期研發(fā)階段，且用于慢病毒載體生產(chǎn)的合適灌流設(shè)備仍需要在臨床/商品化規(guī)模中進(jìn)行優(yōu)化或證實(shí)。此外，懸浮生物反應(yīng)器中的泡沫形成對(duì)于病毒載體生產(chǎn)是個(gè)不小的問(wèn)題。而且，在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞或甚至是適應(yīng)懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，仍可在固定床生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)，因?yàn)榧?xì)胞不管怎樣都會(huì)被截留在固定床的膜結(jié)構(gòu)中。所以，簡(jiǎn)單且溫和的灌流以及不需要額外設(shè)備的優(yōu)勢(shì)，也可使用固定床生物反應(yīng)器在無(wú)血清條件下以及懸浮馴化細(xì)胞中進(jìn)行探索。
 
使用我們目前的參數(shù)，當(dāng)規(guī)模放大至scale-X nitro生物反應(yīng)器（600m2）時(shí)，根據(jù)灌流速率，理論上可生產(chǎn)400 至 600L的慢病毒載體，且病毒產(chǎn)量超于 >10^6 TU/mL（使用我們的HeLa細(xì)胞系進(jìn)行滴度檢測(cè)）和超于 >10^9 vp/mL。這與使用補(bǔ)料分批的200L 攪拌罐生物反應(yīng)器相當(dāng)，其可達(dá)到0.5-5x10^7TU/mL感染性滴度。但是，由于沒有慢病毒載體參考標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)站點(diǎn)間的感染性滴度不能進(jìn)行完全的比較。此外，通常情況下，貼壁細(xì)胞中的慢病毒載體產(chǎn)率高于懸浮生產(chǎn)。這可能是由于不同的細(xì)胞培養(yǎng)基，因?yàn)樘囟ǖ呐囵B(yǎng)基相比其它培養(yǎng)基，可更好地支持轉(zhuǎn)染，獲得更高的產(chǎn)量。也可能部分是由于FBS的存在，其仍常用于貼壁細(xì)胞生產(chǎn)（在我們的整體方案中，直到轉(zhuǎn)染后24h前使用）。此外，不是所有用于生產(chǎn)慢病毒的載體都可在懸浮培養(yǎng)中良好生長(zhǎng)。大體積的慢病毒載體收獲液可能難以進(jìn)行下游處理。每個(gè)慢病毒載體生產(chǎn)商都應(yīng)該考慮下需要多大體積的載體以及如何簡(jiǎn)單且快速地對(duì)易碎的慢病毒進(jìn)行下游處理。即使下游工藝處理之后的收率僅為10%，以scale-X nitro（600m2）生物反應(yīng)器生長(zhǎng)的病毒載體的量，根據(jù)目的應(yīng)用，已經(jīng)可以達(dá)到數(shù)百至數(shù)千的劑量。但是，對(duì)于其它病毒載體的生產(chǎn)，例如AAV，還是需要更大的生物反應(yīng)器，因?yàn)槊總�(gè)患者需要的病毒載體的數(shù)量通常高于慢病毒載體。
  圖4. scale-X hydro生物反應(yīng)器和iCELLis Nano生物反應(yīng)器運(yùn)行中的慢病毒載體產(chǎn)量。（a、b）scale-X生物反應(yīng)器和iCELLis Nano生物反應(yīng)器運(yùn)行中，分別生產(chǎn)的總慢病毒顆粒（vp）和vp/cm2。（c、d）scale-X生物反應(yīng)器和iCELLis Nano生物反應(yīng)器運(yùn)行中，分別生產(chǎn)的總TU和TU/cm2。對(duì)照Nano = Nano 運(yùn)行，與scale-X生物反應(yīng)器運(yùn)行一同進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)Nano = 5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)Nano運(yùn)行的平均值。scale-X 1-4=scale-X生物反應(yīng)器運(yùn)行1-4。平均值±SEM。TU，轉(zhuǎn)導(dǎo)單位；VP，載體顆粒。
 
在iCELLis Nano和scale-X生物反應(yīng)器中進(jìn)行腺病毒載體生產(chǎn)
 
除了慢病毒載體之外（圖4），我們也比較了在iCELLis生物反應(yīng)器和scale-X生物反應(yīng)器中進(jìn)行的腺病毒載體的生產(chǎn)。使用HPLC分析scale-X hydro系統(tǒng)和iCELLis Nano生物反應(yīng)器生產(chǎn)的AdGFP的滴度。澄清后，scale-X生物反應(yīng)器運(yùn)行獲得的滴度為每毫升1.11x10^11病毒顆粒，iCELLis Nano運(yùn)行為每毫升8.53x10^10顆粒。結(jié)果說(shuō)明，scale-X生物反應(yīng)器也可用于腺病毒載體的生產(chǎn)，且獲得與iCELLis系統(tǒng)相當(dāng)?shù)母弋a(chǎn)量。
 
結(jié)論
 
Univercells的scale-X固定床生物反應(yīng)器證實(shí)可高效用于病毒載體生產(chǎn)。通過(guò)細(xì)胞核計(jì)數(shù)、葡萄糖消耗和乳酸生產(chǎn)，監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)。補(bǔ)液策略基于灌流。在scale-X生物反應(yīng)器中，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，且在整個(gè)螺旋纏繞管式固定床中，細(xì)胞分布相對(duì)均勻。慢病毒載體可在scale-X hydro系統(tǒng)中高效生產(chǎn)，與iCELLis Nano相比，scale-X生物反應(yīng)器中生產(chǎn)的慢病毒載體產(chǎn)量相似甚至更高（總量為2.4x10^10 TU，即9.8 x 10^5 TU/cm2）。在對(duì)照的iCELLisNano中，獲得的產(chǎn)量為1.3x10^10TU（4.7x10^5TU/cm2），而在標(biāo)準(zhǔn)的iCELLis Nano中，為1.7x10^10±SD 8.7x10^9TU（=6.4x10^10±SD 3.4x10^5TU/cm2）。此外，腺病毒載體產(chǎn)量在兩種生物反應(yīng)器中相似，iCELLis Nano為8.53x10^10 vp/mL，scale-X hydro為1.11x10^11vp/mL。所以，可見，iCELLis生物反應(yīng)器中用于病毒載體生產(chǎn)的參數(shù)可直接轉(zhuǎn)移到scale-X生物反應(yīng)器上，反之亦然。
 
原文翻譯：H.M.Leinonen, S.Lepola, E.M.Lipponen, et al., Benchmarking of Scale-X Bioreactor System in Lentiviral and Adenoviral Vector Production. Human Gene Therapy, 2020, 31(5&6) : 376 – 384.
    
PEIpro® 系列產(chǎn)品，是專門為基因和細(xì)胞治療市場(chǎng)設(shè)計(jì)開發(fā)的專有轉(zhuǎn)染產(chǎn)品，是獲得可靠的病毒載體生產(chǎn)和高感染滴度的首選轉(zhuǎn)染方法，且從工藝開發(fā)到大規(guī)模臨床級(jí)的病毒生產(chǎn)可直接放大和無(wú)縫過(guò)渡，在各種生產(chǎn)細(xì)胞中病毒產(chǎn)量最高。PEIpro® 完全克服了未經(jīng)提純和優(yōu)化的原始PEI的缺點(diǎn)，遵循非常嚴(yán)格的質(zhì)量控制和法律法規(guī)。PEIpro® 有3個(gè)質(zhì)量等級(jí)的產(chǎn)品：研發(fā)級(jí)的PEIpro®用于工藝開發(fā)，更高質(zhì)量等級(jí)的PEIpro®-HQ用于臨床前研究和早期臨床試驗(yàn)，最高質(zhì)量等級(jí)PEIpro®-GMP用于臨床試驗(yàn)及商業(yè)化階段。
 
詳情請(qǐng)查閱官網(wǎng)：https://www.polyplus-transfection.com
 
Polyplus聯(lián)系人：劉海芹，商務(wù)經(jīng)理，hliu@polyplus-transfection.com
Polyplus技術(shù)支持：support@polyplus-transfection.com