7月8日，國際學(xué)術(shù)期刊Circulation在線發(fā)表了中國科學(xué)院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所周斌研究組與中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院心血管疾病國家重點實驗室聶宇課題組的最新科研成果“Reassessment of c-Kit⁺ Cells for Cardiomyocyte Contribution in Adult Heart”。

該研究利用雙同源重組系統(tǒng)(Cre-loxP和Dre-rox)構(gòu)建了兩個可以有效標(biāo)記Kit⁺細胞且不影響內(nèi)源Kit基因表達的小鼠模型，并利用這些模型對Kit⁺的心臟干細胞(CSCs)是否參與成體心肌細胞的生成進行了探討。

研究結(jié)果顯示，無論心臟處于穩(wěn)態(tài)或損傷狀態(tài)下，都不會參與新生的心肌細胞的生成。 

南模生物為該研究構(gòu)建了Kit-2A-Cre、Kit-IRES-Cre和Tnnt2-DreER這三個小鼠模型。

限于之前的小鼠模型無法有效追蹤CSCs的命運，Kit⁺ CSCs是否具有肌源潛能一直存在爭議[1-3]。

去年發(fā)表在Nature上的一篇文章對已有的Kit-Cre模型進行了總結(jié)，并概括了現(xiàn)有模型的兩大缺陷：1)構(gòu)建時同源重組酶Cre取代了內(nèi)源Kit基因的表達，從而引發(fā)單倍體不足(haploinsufficiency)，即單個Kit等位基因不足以維持其正常功能；2)無法標(biāo)記Kit表達量低的細胞。

為了解決Kit⁺ CSCs是否具有肌源潛能這一問題，本研究另辟蹊徑，構(gòu)建了2個全新的Kit-Cre工具鼠品系(Fig.1)。為了避免對c-Kit基因產(chǎn)生影響，研究人員選擇將Cre插入到Kit的最后一個外顯子后，并通過2A或者IRES元件分隔，從而實現(xiàn)與內(nèi)源Kit共同表達的目的。

Fig.1 Schematic figure showing knock-in strategies for Kit-2A-Cre or Kit-IRES-Crealleles by homologous recombination.

Kit^{2A-Cre/2A-Cre} 和 Kit^{IRES-Cre/IRES-Cre}純合子小鼠可以正常存活至成年，檢測野生型、純合子、雜合子小鼠在大小、體重以及心臟大小、體重占比、功能等生理指標(biāo)均沒有差別，并且Kit在純合小鼠中表達完整(Fig.2)。

Fig.2 Immunostaining for c-Kit on heart sections show its expression in tissues ofall groups (12–16W).

為了確定同時標(biāo)記Kit⁺細胞和心肌細胞，研究人員首先選擇用心肌細胞特異表達的Tnnt2基因標(biāo)來記心肌細胞，為此構(gòu)建了Tnnt2–DreER小鼠模型。隨后通過Kit–2A-Cre;R26–GFP，Tnnt2–DreER;R26–rox–tdTomato交配，利用Cre-loxP和Dre-rox雙同源重組系統(tǒng)，將Kit⁺細胞標(biāo)記為綠色，將心肌細胞標(biāo)記為紅色，這樣就可以從Kit⁺細胞中區(qū)別出非心肌細胞(GFP⁺tdTomat^-)和心肌細胞(GFP⁺tdTomato⁺)(Fig.3)。

Fig.3 Strategy for labeling of Kit⁺ cells by dual recombinases-based system.

那么GFP⁺tdTomat^-的非心肌細胞是否會產(chǎn)生維持GFP⁺tdTomat^-的新生心肌細胞呢？

在小鼠心肌梗死(MI)兩周前進行他莫昔芬誘導(dǎo)，MI四周后進行組織采樣檢測(Fig.4)，觀察發(fā)現(xiàn)GFP⁺tdTomato⁺心肌細胞分布于梗死及梗死邊緣位置，但是在所有的組織切片中都沒有觀察到GFP⁺tdTomato^-心肌細胞，說明心肌梗死后Kit⁺非心肌細胞不參與新生心肌細胞的生成。

Fig.4 Immunostaining for green fluorescent protein (GFP), tdTomato, and Troponin I(TNNI3) on myocardial infarction (MI) heart sections.

利用Kit–IRES–Cre模型替換Kit-2A-Cre模型重復(fù)該研究(Fig.5)，得到的也是相同的結(jié)果。

Fig.5 Immunostaining for GFP, tdTomato, and TNNI3 on MI heart sections.

本研究將兩個新的Kit-Cre模型與雙同源重組酶介導(dǎo)的譜系追蹤策略結(jié)合，追蹤kit在成體心臟中的命運，回避了Kit-Cre譜系追蹤問題；不同于以前的Kit-Cre模型，新的Kit-Cre模型不存在Kit單倍體不足的問題，同時標(biāo)記所有Kit⁺細胞及其后代。

本研究解決了已有Kit-Cre模型的兩大缺陷，間接證明了內(nèi)源的Kit⁺CSCs不是成體心臟心肌更新和修復(fù)所必需的。

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