隨著基因編輯技術(shù)的迭代更新和模型構(gòu)建費(fèi)用的降低，基因敲除（KO）小鼠使用已成為學(xué)者開展科研項(xiàng)目時(shí)的優(yōu)先選擇項(xiàng)。市售的成品敲除模型鼠種類繁多，在經(jīng)歷了相當(dāng)長時(shí)間的繁育等待后，拿到純合子敲除模型的小伙伴最后發(fā)現(xiàn)仍能檢測到敲除的目的蛋白表達(dá)�。�缺少這么重要的數(shù)據(jù)，下一步課題怎么開展？論文怎么發(fā)表？科研經(jīng)費(fèi)和時(shí)間都被浪費(fèi)掉了，真是賠了夫人又折兵啊。
 

濟(jì)世金編根據(jù)多年的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，幫助各位學(xué)者理清可能原因：

1、蛋白驗(yàn)證的影響因素：

1) 抗體的特異性：非特異性條帶是蛋白檢測中最常見的問題，使用高質(zhì)量、特異性強(qiáng)的抗體是獲得可靠結(jié)果的關(guān)鍵。針對(duì)這一問題，可以結(jié)合PCR的方法對(duì)敲除基因mRNA的表達(dá)進(jìn)行檢測，當(dāng)未檢測到敲除基因mRNA表達(dá)的情況下，需要考慮更換另一家公司抗體進(jìn)行檢測目的蛋白。

2) 抗體的結(jié)合位點(diǎn)：移碼突變型的敲除可以表達(dá)出目的基因N端的部分肽段，如果所使用的抗體結(jié)合位點(diǎn)剛好在表達(dá)的殘留蛋白上是可能被檢測到的。所以在選擇抗體的時(shí)候盡可能選擇識(shí)別C端肽段的抗體。

2、基因敲除方式的影響因素：

市面上絕大多數(shù)的成品敲除模型采用的是移碼突變的構(gòu)建方式，這些模型只經(jīng)過了基因組DNA的PCR驗(yàn)證，表明移碼突變成功；但未進(jìn)行RT-PCR（mRNA表達(dá)）或WB（蛋白表達(dá)）的驗(yàn)證。移碼突變是指DNA鏈上插入或缺失1個(gè)、2個(gè)甚至多個(gè)堿基（非3個(gè)堿基或3的整數(shù)倍的堿基），導(dǎo)致在插入或缺失堿基部位以后的密碼子順序和組成發(fā)生相應(yīng)改變。這種構(gòu)建方式的弊端是：由于原來的密碼子移位，終止密碼子常常推后或提前出現(xiàn)，結(jié)果造成新合成的肽鏈延長或縮短，容易出現(xiàn)截?cái)嗟鞍讱埩?/span>，對(duì)抗體的結(jié)合位點(diǎn)產(chǎn)生干擾。

更要命的是，移碼突變的模型構(gòu)建方式有可能導(dǎo)致未知肽段或蛋白的生成。這使我們無法確認(rèn)利用這種敲除方式準(zhǔn)備的模型，其病理或功能上的表型是否是由目的基因功能缺失引起的，甚至?xí)�影響到整個(gè)研究的結(jié)果。

3、推薦的解決方案：

目的基因完全敲除的小鼠模型構(gòu)建方式

這種構(gòu)建方式是在受精卵胚胎中精準(zhǔn)地完全刪除或盡可能刪除最大片段的目的基因組序列。通過這種方式構(gòu)建的基因敲除小鼠，其目的基因無法進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，最大程度的避免了前面提到的移碼突變敲除方式所帶來的檢測問題及潛在的異常蛋白干擾風(fēng)險(xiǎn)，是目前基因敲除動(dòng)物制備的發(fā)展趨勢。

案例：Dcaf8基因完全敲除小鼠模型

        需要注意的是，由于特定基因的基因組區(qū)域可能包含其他必要信息，在選擇完全敲除這種模型構(gòu)建方式時(shí)需要有專業(yè)的技術(shù)人員對(duì)目的基因的功能和基因組序列進(jìn)行評(píng)估。