論成熟的免疫療法為何成熟至能被納入美國醫(yī)保
2012年，6歲的急性淋巴細胞白血病小女孩Emily在無藥可醫(yī)的情況下，嘗試了Carl June實驗室的研究性CAR-T細胞治療，奇跡至此發(fā)生，治療后她一直健康的生存至今。CD19 CAR T細胞治療自此以百米速度進入公眾視野和臨床實踐。其中CAR，即嵌合抗原受體，是該治療的核心要素。7月5日，CAR-T細胞的發(fā)明者之一，有著“CAR T細胞之父”之稱的Carl June教授又在國際著名雜志NEJM發(fā)文，論述了CAR-T細胞治療的發(fā)展簡史，著重于現(xiàn)有CAR-T治療的有效性和毒性作用，并展望了CAR-T治療的未來發(fā)展與挑戰(zhàn)。本期就為大家一一呈現(xiàn)！
Carl June博士(圖片來源 parkerici.org)
CAR-T細胞治療是一種典型的腫瘤免疫療法。癌癥免疫治療是通過增加機體對腫瘤細胞的免疫反應(yīng)達到治療癌癥的目的，其作為新型治療策略，與化療、手術(shù)、放療及小分子靶向藥物聯(lián)合，已在轉(zhuǎn)移癌治療上取得成功。免疫腫瘤學(xué)藥物涵蓋廣泛，包括抗體、疫苗、細胞因子、溶瘤病毒、雙特異分子和細胞治療等�；蚬こ袒疶細胞是一類新的治療藥物，而其中基于嵌合抗原受體（CAR）T細胞的治療方法目前已獲FDA批準治療白血病和淋巴瘤。
視頻（CAR T療法工作原理）
免疫腫瘤學(xué)的核心挑戰(zhàn)是，多數(shù)腫瘤抗原為自身抗原，在正常組織也可表達，由于機體的自我保護機制，這一類的抗原往往無法有效引起免疫系統(tǒng)的活化，因此抗腫瘤免疫反應(yīng)多短暫且療效欠佳，這是因為宿主免疫反應(yīng)的進化過程中會趨向于阻止自身免疫發(fā)生，而通過對T細胞的基因直接進行編輯的基因工程恰恰可以幫助克服這種免疫耐受。
CARs的結(jié)構(gòu)
CARs是人工合成的，自然中并未發(fā)現(xiàn)存在的人造受體，通過基因編輯技術(shù)植入T細胞后可以直接重塑T細胞的特異性、功能和代謝。CARs 包括T細胞活化區(qū)和胞外由免疫球蛋白重鏈與輕鏈衍生的單鏈抗體（scFv），與T細胞的特異性相關(guān)。上述結(jié)構(gòu)稱作一代CARs，非HLA依賴性識別抗原，因其信號能力有限而不能實現(xiàn)持續(xù)T細胞反應(yīng)。
與單鏈抗體相連的嵌合共刺激受體，能增加T細胞增殖和抗凋亡能力，是雙重信號CARs成功的基礎(chǔ)，功能性T細胞重復(fù)抗原暴露后可有效擴增，這類受體稱作二代CARs，可產(chǎn)生持續(xù)作用，是現(xiàn)代CAR-T細胞治療的基礎(chǔ)。
T細胞受體和CAR的結(jié)構(gòu)
CD19 CAR-T是目前最成功的細胞療法
靶向CD19 的CAR-T是目前最成功，應(yīng)用最多的細胞療法。之所以選擇CD19作為靶點，是因其頻繁表達于B細胞白血病和淋巴瘤，且表達程度和水平遠高于其它潛在靶點如CD20、CD22。CD19還可表達于正常B細胞，因此可致B細胞增生不良，可通過輸注免疫球蛋白減輕B細胞減少對體液免疫的影響，B細胞增生不良先于機體對CAR產(chǎn)生的抗體反應(yīng)。
2017年FDA批準研究性CD19 CAR-T治療，該治療中采用了γ逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體編碼含CD28或4-1BB共刺激分子的CARs。臨床研究很快顯示出該藥對復(fù)發(fā)難治B細胞腫瘤的有效性，而且治療反應(yīng)具有可持續(xù)性。
目前雖缺少各類CAR-T細胞治療的頭對頭研究，但根據(jù)現(xiàn)有研究結(jié)果可得出如下結(jié)論：含有小鼠序列的藥物可觸發(fā)宿主免疫導(dǎo)致藥物失效，缺少免疫原性可使CAR-T細胞持續(xù)存在，改善白血病復(fù)發(fā)生存，因此CAR設(shè)計以全人源化序列為優(yōu)選。此外，有報道顯示，使用CD28共刺激因子的CARs有潛在的神經(jīng)毒性風(fēng)險，然而仍需要進一步的研究方能確認兩者之間的關(guān)聯(lián)性。
CAR-T細胞療法的毒性作用依然不可忽視
所有癌癥治療均有副反應(yīng)，CAR-T細胞也不例外，其毒性主要來自脫靶作用，與抗體單鏈可變區(qū)片段的特異性和T細胞活化有關(guān)。當(dāng)靶細胞被清除或植入的CAR-T細胞消失后，副反應(yīng)也隨之消失，這與傳統(tǒng)細胞毒化療的脫靶毒性作用完全不同。傳統(tǒng)化療毒性可導(dǎo)致組織細胞永久性遺傳學(xué)改變，甚至累及干細胞，從而影響長期臨床結(jié)果。
B細胞增生不良是可預(yù)測的不良反應(yīng)，因為CARs靶向的是B細胞分化抗原。臨床研究顯示，CD19 CARs所致的B細胞增生不良更徹底，超過了利妥昔單抗，在CAR-T細胞去除后可快速恢復(fù)。CAR所致B細胞增生不良的治療指南不斷完善，成人和兒童治療并不相同，因為兒童具有不完全的長期存活的漿細胞和較弱的體液免疫。
此外，CAR-T細胞治療時，部分患者出現(xiàn)發(fā)熱、低血氧、低血壓和神經(jīng)系統(tǒng)改變，伴明顯細胞因子增高，上述改變稱作細胞因子釋放綜合征（CRS），其發(fā)生與CD19和B細胞成熟抗原（BCMA）CARs相關(guān)。就CD19 CARs而言，CRS的嚴重程度與腫瘤負荷相關(guān)，甚至可發(fā)展為危脅生命的毛細血管滲漏綜合征。對CAR治療無反應(yīng)患者少有CRS發(fā)作。CRS發(fā)生與T細胞活化和高水平細胞因子有關(guān)，如干擾素γ和IL-6。托珠單抗為IL-6受體拮抗劑，對嚴重CRS有治療作用，已獲FDA批準使用。如阻滯IL-6受體仍不能快速緩解癥狀，應(yīng)立即糖皮質(zhì)激素治療。
所有針對CD19和BCMA的CAR-T細胞治療都具有神經(jīng)毒性，雙特異性抗CD19和CD3單抗blinatumomab也有類似神經(jīng)毒性，因此推測神經(jīng)毒性的發(fā)生與針對CD19靶抗原相關(guān)。雖然造成神經(jīng)毒性的具體機制并不清楚，但毒性通常完全可逆，與癌癥中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）轉(zhuǎn)移并無關(guān)系，神經(jīng)毒性發(fā)作時可發(fā)生腦水腫，目前治療仍是經(jīng)驗性治療。因為CRS風(fēng)險和神經(jīng)毒性，F(xiàn)DA要求使用CAR-T細胞治療前，醫(yī)師和醫(yī)院工作人員要完成副作用治療的相關(guān)培訓(xùn)。
病毒載體整合進入人體也是需要關(guān)注的安全問題。目前已有超過1000例患者接受了T細胞受體或CAR調(diào)整后T細胞的治療，尚未發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)化。
其它類型CAR治療
CD19 CAR-T治療是目前最成功、也是最廣為人知的CAR-T治療，從中可得出一些結(jié)果：B細胞增生不良說明CAR-T細胞也可對正常組織造成損害，雖然CD19 CAR-T治療的這一副作用并不危脅生命，但其它靶點的其它副作用可能會危脅生命；CD19 CAR-T治療完全緩解后復(fù)發(fā)時CD19陰性，說明存在抗原逃逸；靶向CD19的有效性優(yōu)于CD20和CD22，提示高密度CAR靶點表達療效更優(yōu)；一些髓外疾病，如后腹膜或CNS白血病，對治療無反應(yīng)，缺少髓外疾病反應(yīng)率的正式評估數(shù)據(jù)；不清楚為什么急性淋巴細胞白血病的CD19 CAR-T治療反應(yīng)明顯優(yōu)于慢性淋巴細胞白血病或非霍奇金淋巴瘤，疾病部位、腫瘤微環(huán)境和宿主T細胞功能可能與之相關(guān)。
CAR治療對B細胞腫瘤的有效性為其它惡性血液腫瘤的治療提供了范例，現(xiàn)已開始探討治療多發(fā)性骨髓瘤的CAR靶點，如kappa輕鏈、CD138、Lewis Y抗原、BCMA、CS1 、CD38和整合素β，其中靶向BCMA的研究結(jié)果很好。急性髓系白血病的CAR靶點也在探討中，包括CD33、CLEC12A、CD44v6、EMR2、Tim3、CD70、Lewis Y抗原、CD123和葉酸受體β，其中CD123 CAR-T細胞可導(dǎo)致致死性并發(fā)癥，因此需要謹慎評估此靶點。對缺少類似CD19這樣優(yōu)質(zhì)靶點的疾病，同時靶向≥2個抗原，對減少抗原逃逸、同時不加重毒性有一定作用。
細胞工程與合成生物學(xué)
遺傳工程與合成生物學(xué)的聯(lián)合與發(fā)展為制造更強功能的T細胞提供了可能：組合靶點T細胞，可識別2種抗原，增加了治療的有效性和安全性；工程化T細胞可作為載體進入腫瘤微環(huán)境；通過可控式自殺開關(guān)進一步改善T細胞的使用安全性；核酸酶為T細胞基因敲除或轉(zhuǎn)基因提供了新方法�？傊�，技術(shù)的發(fā)展與整合，為更強功能細胞的發(fā)展提供了無限可能。
挑戰(zhàn)與未來
CAR-T細胞療法在實體瘤中仍需不斷探索
CD19 CAR-T細胞是首個獲得商業(yè)批準的轉(zhuǎn)基因治療。遺傳工程化T細胞作為癌癥精準治療，其中最重要的科學(xué)挑戰(zhàn)是CAR-T細胞如何治療實體瘤，目前最突出的例子就是顱內(nèi)使用IL13RαCAR T細胞治療多發(fā)腦惡性膠質(zhì)瘤，使腫瘤顯著退縮，但在其它實體瘤的治療上仍處于探索階段，不但要療效顯著，同時還要預(yù)防或減少相關(guān)副作用。
通用性CAR-T是未來發(fā)展方向
自體CAR-T細胞治療的巨大花費和治療復(fù)雜性使其廣泛應(yīng)用受限。目前已通過多種基因編輯技術(shù)發(fā)展出普遍適用的CAR-T細胞，并在幾名急性前B淋巴細胞白血病患兒中治療成功，但普遍適用T細胞面臨的最大挑戰(zhàn)是如何避免宿主抗移植物反應(yīng)和移植物抗宿主反應(yīng)。采用人類胚胎干細胞和可誘導(dǎo)多潛能干細胞作為T細胞來源，采用多種技術(shù)有可能生產(chǎn)出具有多種優(yōu)秀特質(zhì)的T細胞，包括抗原特異性、無同種異體反應(yīng)、組織相容性和功能增強。
成型的商業(yè)模式
自CD19 CAR-T細胞治療腫瘤的獲批，促進了工程化細胞治療其它疾病的轉(zhuǎn)化。現(xiàn)全球在ClinicalTrials.gov上登記的CAR-T細胞治療臨床試驗已達250多個，，多數(shù)集中在美國和中國，少部分在歐洲和日本�？傊梢灶A(yù)見，CAR-T細胞作為癌癥治療的突破性療法，在各國政策的扶持下，在龐大的人才紅利下，加上細胞載體本身的高度可塑性，特別是基因編輯技術(shù)與細胞治療結(jié)合的產(chǎn)物UCAR-T（通用性CAR-T）的發(fā)展，有望更快速、高效實現(xiàn)“現(xiàn)成(off the shelf)”的同批次同質(zhì)量規(guī)�；募毎幬铮@將更快推動細胞治療藥物的產(chǎn)業(yè)化之路。
CAR-T臨床研究在全球分布 (圖片來源Science)
參考文獻
June, Carl H., and Michel Sadelain. "Chimeric Antigen Receptor Therapy." New England Journal of Medicine 379.1 (2018): 64-73.
June C H, Connor R S, Kawalekar O U, et al. CAR T cell immunotherapy for human cancer[J]. Science, 2018, 359(6382): 1361-1365.
Carl June博士(圖片來源 parkerici.org)
CAR-T細胞治療是一種典型的腫瘤免疫療法。癌癥免疫治療是通過增加機體對腫瘤細胞的免疫反應(yīng)達到治療癌癥的目的，其作為新型治療策略，與化療、手術(shù)、放療及小分子靶向藥物聯(lián)合，已在轉(zhuǎn)移癌治療上取得成功。免疫腫瘤學(xué)藥物涵蓋廣泛，包括抗體、疫苗、細胞因子、溶瘤病毒、雙特異分子和細胞治療等�；蚬こ袒疶細胞是一類新的治療藥物，而其中基于嵌合抗原受體（CAR）T細胞的治療方法目前已獲FDA批準治療白血病和淋巴瘤。
視頻（CAR T療法工作原理）
免疫腫瘤學(xué)的核心挑戰(zhàn)是，多數(shù)腫瘤抗原為自身抗原，在正常組織也可表達，由于機體的自我保護機制，這一類的抗原往往無法有效引起免疫系統(tǒng)的活化，因此抗腫瘤免疫反應(yīng)多短暫且療效欠佳，這是因為宿主免疫反應(yīng)的進化過程中會趨向于阻止自身免疫發(fā)生，而通過對T細胞的基因直接進行編輯的基因工程恰恰可以幫助克服這種免疫耐受。
CARs的結(jié)構(gòu)
CARs是人工合成的，自然中并未發(fā)現(xiàn)存在的人造受體，通過基因編輯技術(shù)植入T細胞后可以直接重塑T細胞的特異性、功能和代謝。CARs 包括T細胞活化區(qū)和胞外由免疫球蛋白重鏈與輕鏈衍生的單鏈抗體（scFv），與T細胞的特異性相關(guān)。上述結(jié)構(gòu)稱作一代CARs，非HLA依賴性識別抗原，因其信號能力有限而不能實現(xiàn)持續(xù)T細胞反應(yīng)。
與單鏈抗體相連的嵌合共刺激受體，能增加T細胞增殖和抗凋亡能力，是雙重信號CARs成功的基礎(chǔ)，功能性T細胞重復(fù)抗原暴露后可有效擴增，這類受體稱作二代CARs，可產(chǎn)生持續(xù)作用，是現(xiàn)代CAR-T細胞治療的基礎(chǔ)。
T細胞受體和CAR的結(jié)構(gòu)
CD19 CAR-T是目前最成功的細胞療法
靶向CD19 的CAR-T是目前最成功，應(yīng)用最多的細胞療法。之所以選擇CD19作為靶點，是因其頻繁表達于B細胞白血病和淋巴瘤，且表達程度和水平遠高于其它潛在靶點如CD20、CD22。CD19還可表達于正常B細胞，因此可致B細胞增生不良，可通過輸注免疫球蛋白減輕B細胞減少對體液免疫的影響，B細胞增生不良先于機體對CAR產(chǎn)生的抗體反應(yīng)。
2017年FDA批準研究性CD19 CAR-T治療，該治療中采用了γ逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體編碼含CD28或4-1BB共刺激分子的CARs。臨床研究很快顯示出該藥對復(fù)發(fā)難治B細胞腫瘤的有效性，而且治療反應(yīng)具有可持續(xù)性。
目前雖缺少各類CAR-T細胞治療的頭對頭研究，但根據(jù)現(xiàn)有研究結(jié)果可得出如下結(jié)論：含有小鼠序列的藥物可觸發(fā)宿主免疫導(dǎo)致藥物失效，缺少免疫原性可使CAR-T細胞持續(xù)存在，改善白血病復(fù)發(fā)生存，因此CAR設(shè)計以全人源化序列為優(yōu)選。此外，有報道顯示，使用CD28共刺激因子的CARs有潛在的神經(jīng)毒性風(fēng)險，然而仍需要進一步的研究方能確認兩者之間的關(guān)聯(lián)性。
CAR-T細胞療法的毒性作用依然不可忽視
所有癌癥治療均有副反應(yīng)，CAR-T細胞也不例外，其毒性主要來自脫靶作用，與抗體單鏈可變區(qū)片段的特異性和T細胞活化有關(guān)。當(dāng)靶細胞被清除或植入的CAR-T細胞消失后，副反應(yīng)也隨之消失，這與傳統(tǒng)細胞毒化療的脫靶毒性作用完全不同。傳統(tǒng)化療毒性可導(dǎo)致組織細胞永久性遺傳學(xué)改變，甚至累及干細胞，從而影響長期臨床結(jié)果。
B細胞增生不良是可預(yù)測的不良反應(yīng)，因為CARs靶向的是B細胞分化抗原。臨床研究顯示，CD19 CARs所致的B細胞增生不良更徹底，超過了利妥昔單抗，在CAR-T細胞去除后可快速恢復(fù)。CAR所致B細胞增生不良的治療指南不斷完善，成人和兒童治療并不相同，因為兒童具有不完全的長期存活的漿細胞和較弱的體液免疫。
此外，CAR-T細胞治療時，部分患者出現(xiàn)發(fā)熱、低血氧、低血壓和神經(jīng)系統(tǒng)改變，伴明顯細胞因子增高，上述改變稱作細胞因子釋放綜合征（CRS），其發(fā)生與CD19和B細胞成熟抗原（BCMA）CARs相關(guān)。就CD19 CARs而言，CRS的嚴重程度與腫瘤負荷相關(guān)，甚至可發(fā)展為危脅生命的毛細血管滲漏綜合征。對CAR治療無反應(yīng)患者少有CRS發(fā)作。CRS發(fā)生與T細胞活化和高水平細胞因子有關(guān)，如干擾素γ和IL-6。托珠單抗為IL-6受體拮抗劑，對嚴重CRS有治療作用，已獲FDA批準使用。如阻滯IL-6受體仍不能快速緩解癥狀，應(yīng)立即糖皮質(zhì)激素治療。
所有針對CD19和BCMA的CAR-T細胞治療都具有神經(jīng)毒性，雙特異性抗CD19和CD3單抗blinatumomab也有類似神經(jīng)毒性，因此推測神經(jīng)毒性的發(fā)生與針對CD19靶抗原相關(guān)。雖然造成神經(jīng)毒性的具體機制并不清楚，但毒性通常完全可逆，與癌癥中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）轉(zhuǎn)移并無關(guān)系，神經(jīng)毒性發(fā)作時可發(fā)生腦水腫，目前治療仍是經(jīng)驗性治療。因為CRS風(fēng)險和神經(jīng)毒性，F(xiàn)DA要求使用CAR-T細胞治療前，醫(yī)師和醫(yī)院工作人員要完成副作用治療的相關(guān)培訓(xùn)。
病毒載體整合進入人體也是需要關(guān)注的安全問題。目前已有超過1000例患者接受了T細胞受體或CAR調(diào)整后T細胞的治療，尚未發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)化。
其它類型CAR治療
CD19 CAR-T治療是目前最成功、也是最廣為人知的CAR-T治療，從中可得出一些結(jié)果：B細胞增生不良說明CAR-T細胞也可對正常組織造成損害，雖然CD19 CAR-T治療的這一副作用并不危脅生命，但其它靶點的其它副作用可能會危脅生命；CD19 CAR-T治療完全緩解后復(fù)發(fā)時CD19陰性，說明存在抗原逃逸；靶向CD19的有效性優(yōu)于CD20和CD22，提示高密度CAR靶點表達療效更優(yōu)；一些髓外疾病，如后腹膜或CNS白血病，對治療無反應(yīng)，缺少髓外疾病反應(yīng)率的正式評估數(shù)據(jù)；不清楚為什么急性淋巴細胞白血病的CD19 CAR-T治療反應(yīng)明顯優(yōu)于慢性淋巴細胞白血病或非霍奇金淋巴瘤，疾病部位、腫瘤微環(huán)境和宿主T細胞功能可能與之相關(guān)。
CAR治療對B細胞腫瘤的有效性為其它惡性血液腫瘤的治療提供了范例，現(xiàn)已開始探討治療多發(fā)性骨髓瘤的CAR靶點，如kappa輕鏈、CD138、Lewis Y抗原、BCMA、CS1 、CD38和整合素β，其中靶向BCMA的研究結(jié)果很好。急性髓系白血病的CAR靶點也在探討中，包括CD33、CLEC12A、CD44v6、EMR2、Tim3、CD70、Lewis Y抗原、CD123和葉酸受體β，其中CD123 CAR-T細胞可導(dǎo)致致死性并發(fā)癥，因此需要謹慎評估此靶點。對缺少類似CD19這樣優(yōu)質(zhì)靶點的疾病，同時靶向≥2個抗原，對減少抗原逃逸、同時不加重毒性有一定作用。
細胞工程與合成生物學(xué)
遺傳工程與合成生物學(xué)的聯(lián)合與發(fā)展為制造更強功能的T細胞提供了可能：組合靶點T細胞，可識別2種抗原，增加了治療的有效性和安全性；工程化T細胞可作為載體進入腫瘤微環(huán)境；通過可控式自殺開關(guān)進一步改善T細胞的使用安全性；核酸酶為T細胞基因敲除或轉(zhuǎn)基因提供了新方法�？傊�，技術(shù)的發(fā)展與整合，為更強功能細胞的發(fā)展提供了無限可能。
挑戰(zhàn)與未來
CAR-T細胞療法在實體瘤中仍需不斷探索
CD19 CAR-T細胞是首個獲得商業(yè)批準的轉(zhuǎn)基因治療。遺傳工程化T細胞作為癌癥精準治療，其中最重要的科學(xué)挑戰(zhàn)是CAR-T細胞如何治療實體瘤，目前最突出的例子就是顱內(nèi)使用IL13RαCAR T細胞治療多發(fā)腦惡性膠質(zhì)瘤，使腫瘤顯著退縮，但在其它實體瘤的治療上仍處于探索階段，不但要療效顯著，同時還要預(yù)防或減少相關(guān)副作用。
通用性CAR-T是未來發(fā)展方向
自體CAR-T細胞治療的巨大花費和治療復(fù)雜性使其廣泛應(yīng)用受限。目前已通過多種基因編輯技術(shù)發(fā)展出普遍適用的CAR-T細胞，并在幾名急性前B淋巴細胞白血病患兒中治療成功，但普遍適用T細胞面臨的最大挑戰(zhàn)是如何避免宿主抗移植物反應(yīng)和移植物抗宿主反應(yīng)。采用人類胚胎干細胞和可誘導(dǎo)多潛能干細胞作為T細胞來源，采用多種技術(shù)有可能生產(chǎn)出具有多種優(yōu)秀特質(zhì)的T細胞，包括抗原特異性、無同種異體反應(yīng)、組織相容性和功能增強。
成型的商業(yè)模式
自CD19 CAR-T細胞治療腫瘤的獲批，促進了工程化細胞治療其它疾病的轉(zhuǎn)化。現(xiàn)全球在ClinicalTrials.gov上登記的CAR-T細胞治療臨床試驗已達250多個，，多數(shù)集中在美國和中國，少部分在歐洲和日本�？傊梢灶A(yù)見，CAR-T細胞作為癌癥治療的突破性療法，在各國政策的扶持下，在龐大的人才紅利下，加上細胞載體本身的高度可塑性，特別是基因編輯技術(shù)與細胞治療結(jié)合的產(chǎn)物UCAR-T（通用性CAR-T）的發(fā)展，有望更快速、高效實現(xiàn)“現(xiàn)成(off the shelf)”的同批次同質(zhì)量規(guī)�；募毎幬铮@將更快推動細胞治療藥物的產(chǎn)業(yè)化之路。
CAR-T臨床研究在全球分布 (圖片來源Science)
參考文獻
June, Carl H., and Michel Sadelain. "Chimeric Antigen Receptor Therapy." New England Journal of Medicine 379.1 (2018): 64-73.
June C H, Connor R S, Kawalekar O U, et al. CAR T cell immunotherapy for human cancer[J]. Science, 2018, 359(6382): 1361-1365.
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