基因治療（Gene Therapy）是指將外源正�；�因?qū)�入靶細胞，以糾正或補償缺陷和異�；�因引起的疾病，以達到治療目的。目前已在癌癥、遺傳性疾病如地中海貧血，鐮刀狀貧血癥、血友病及先天性黑蒙癥等多種疾病中表現(xiàn)出巨大的治療潛力。基因治療以其一次給藥終身治愈遺傳疾病的獨特潛力讓一切不可能變?yōu)橛锌赡堋?br />
癌癥和罕見病是目前基因治療聚焦最多的領(lǐng)域
根據(jù)Pharma projects在2018年的報告[1]，目前基因治療類別主要涉及到：癌癥，單基因罕見遺傳病，心血管疾病，傳染病等，癌癥和罕見病是當前基因治療臨床研究最多的兩個領(lǐng)域，下圖展示了截止2017年基因治療的臨床試驗適應(yīng)癥的數(shù)目。


基因治療如何分類？
廣義的基因治療是指把某些遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者體內(nèi)，使其在體內(nèi)表達，最終達到治療某種疾病的方法。而狹義的基因治療是指將發(fā)揮正常功能的基因以修正或置換原有缺陷基因的方式以達到治療的目的。
目前基因治療主要分為以下三類，包括根據(jù)治療途徑、操作方式和靶細胞進行分類。

一、根據(jù)載體給藥途徑可分為體內(nèi)和體外基因治療兩種（圖2）：
1. 體內(nèi)途徑（in vivo）（原位細胞基因治療）：利用非病毒或病毒載體（或是基于病毒和基于基因編輯的方式）直接將治療基因遞送到患者病患部位，從而治療疾病。這一方法操作方便，對于一些體外無法培養(yǎng)的細胞類型是最優(yōu)選擇。但由于體內(nèi)編輯的不確定性，很多隨機整合或脫靶等事件無法避免，且一些病毒載體會使機體出現(xiàn)危及生命的免疫反應(yīng)。

2. 體外途徑（ex vivo）（患者細胞離體被修飾，然后再移植回來）：直接取患者自身的病變細胞，在體外通過基因?qū)�入的方式修飾病變細胞，使其能高效表達治療型蛋白，然后體外擴增，最后回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)達到治療疾病的目的。這一方法可在利用自體細胞不會產(chǎn)生免疫排斥等免疫反應(yīng)，還可在體外篩選到高效轉(zhuǎn)導以及無脫靶的細胞，實現(xiàn)高效安全的基因治療效果。但是由于步驟繁瑣，細胞活力低等缺點也受到一定的局限。
體內(nèi)外基因治療的主要區(qū)別因素之一是載體的選擇（圖3）。如上所述，載體可以分為整合型載體和非整合型載體。那么如何選擇呢？
l 當將遺傳物質(zhì)引入干細胞時，優(yōu)先使用整合型載體，這樣供體的DNA將被整合到干細胞的基因組中，在細胞分裂的過程中將被復制，從而遺傳物質(zhì)能被傳遞到所有子代細胞。
l 對于體內(nèi)基因治療而言，則通常靶向有絲分裂后的細胞。在這些細胞中，由于它們不會再分裂，只要導入的外源基因在細胞中穩(wěn)定存在，就可以實現(xiàn)長期表達；穩(wěn)定的游離體足以驅(qū)動外源基因的細胞周期性表達。


目前大多數(shù)用于遺傳疾病的基因治療策略主要圍繞兩種載體：

1) 用于體外基因轉(zhuǎn)導到造血和其他干細胞的慢病毒（LV）載體：如bluedird Bio公司；LentiGlobin是一種基于慢病毒載體的體外基因療法，該療法雖表現(xiàn)出極大的潛力，但是半隨機的載體整合方式，具有致癌風險；同時慢病毒中的表達原件在造血干細胞長期歸巢和自我更新的過程中會逐漸沉默，使得療效下降，極有可能無法達到終身治愈的目的。并且這種方法需要大量病毒，即意味著巨額的花費花費較高。

2) 用于體內(nèi)基因轉(zhuǎn)導到有絲分裂后細胞類型的腺相關(guān)病毒（AAV）載體：如Spark的Luxturna是2017年獲批上市的一款用于治療RPE65基因缺陷的遺傳性視網(wǎng)膜病變。通過AAV病毒攜帶正常的RPE65基因，注射入視網(wǎng)膜內(nèi)，正常的RPE65基因并不整合到人體細胞的DNA中，而是在細胞核中合成正常的RPE65蛋白，從而觸發(fā)光傳導通路，恢復正常的視覺功能。


二、按基因操作的方式來講分為兩類（圖4）：
1. 基因增強（gene augmentation）和基因失活（gene suppression）：通過導入外源基因使其表達正常產(chǎn)物，從而補償缺陷基因等的功能，不需要除異�；�因；或特異封閉某些基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄，以達到抑制某些異常基因的表達。

2. 基因編輯（Genome editing），又分為基因糾正（gene correction）、基因敲除（gene knockout）和基因添加（gene addtion）：通過定點整合技術(shù)將外源正常的基因在特定位點進行替換或插入，將缺陷基因的異常序列進行矯正和原位特異性修復，不涉及基因組的其他任何改變。


根據(jù)靶細胞的不同可分為體細胞和生殖細胞兩類：
1. 體細胞（Somatic cell）基因治療是指將正�；�因轉(zhuǎn)移到體細胞，使之表達基因產(chǎn)物，以達到治療目的。這種方法一般是將外源正�；�因?qū)�入靶體細胞內(nèi)染色體特定基因座位，用健康的基因替換異常的基因，使其發(fā)揮治療作用，同時還須減少隨機插入引起新的基因突變的可能性。對基因組的定點整合，目前還存在很大的困難。

2. 生殖細胞（Germ cell）基因治療是將正�；�因直接引入生殖細胞，以糾正缺陷基因。不僅可使遺傳疾病在當代得到治療，而且還能將新基因傳給患者后代，使遺傳病得到根治。但生殖細胞的基因治療涉及問題較多，技術(shù)也較復雜，因此，如今更多采用的是體細胞基因治療。
以上2種方式的最大區(qū)別是否對后代產(chǎn)生影響。生殖細胞基因治療由于會將基因遺傳給后代，涉及遺傳和倫理學問題以及當前的技術(shù)限制，生殖細胞基因治療法尚屬禁區(qū)。如2003年頒布的《人胚胎干細胞研究倫理指導原則》規(guī)定，可以以研究為目的，對人體胚胎實施基因編輯和修飾，但體外培養(yǎng)期限自受精或者核移植開始不得超過14天。因此2018年出現(xiàn)的賀建奎編輯胎兒事件屬于被明令禁止的，應(yīng)按照中國有關(guān)法律和條例進行處理。因此在現(xiàn)有條件下，體細胞基因治療成為主要的治療方法。

基因治療的發(fā)展歷程
第一個成功的基因治療案例是通過移植基因校正的自體造血干細胞來治療原發(fā)性免疫缺陷病，盡管展現(xiàn)了良好的治療效果，但是由于整合載體的插入突變導致的惡性轉(zhuǎn)化和腺病毒載體試驗中的患者死亡等不良事件的影響，導致基因治療一度陷入低迷期[3]。

近幾年來隨著病毒載體的優(yōu)化改造以及基因編輯技術(shù)的異軍突起，基因治療重新引來了新的曙光，主要是由于在利用體外策略（針對X連鎖脊髓損傷、腺苷脫氨酶缺乏和腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良）和體內(nèi)方法（2型Leber先天性黑蒙癥和B型血友病）的臨床試驗中取得了突破性成功，如2018年底，Editas Medicine公司（張鋒創(chuàng)辦）宣布，其用于治療Leber先天性黑朦10型患者（LCA10）的基因療法（名為：EDIT-101）已經(jīng)獲得美國FDA批準，EDIT-101有望成為世界上第一款在人體內(nèi)使用的CRISPR療法。EDIT-101通過視網(wǎng)膜下注射給藥，將基因編輯系統(tǒng)直接輸送到感光細胞中而達到治療效果，目前已獲得FDA批準進入臨床。

自2012年至今，西方國家已經(jīng)批準了六種基因療法：
1) 格列貝拉是一種基于AAV的家族性脂蛋白脂肪酶缺乏療法，于2012年獲得了歐洲藥品管理局( EMA )的有條件營銷批準。
2) IMLYGIC是一種基因修飾的1型單純皰疹病毒，用于黑色素瘤患者不可切除病變的局部治療，于2015年獲得美國食品和藥物管理局批準。
3) Strimvelis是一種基于γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒的療法，用于治療腺苷脫氨酶缺乏引起的嚴重聯(lián)合免疫缺陷( ADA-SCID )，于2016年獲得EMA批準。
4) 2017年，美國FDA批準了三種基因療法。KYMRIAH和YESCARTA是CD19導向的基因修飾自體CAR T細胞免疫療法；兩者都適用于非霍奇金淋巴瘤的治療，KYMRIAH也適用于急性淋巴細胞白血病的治療。
5) LUXTURNA是一種基于AAV的基因療法，用于治療雙等位基因RPE65突變相關(guān)的視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良。
下圖展示了1995年-2018年期間全球注冊并開發(fā)的基因治療與臨床項目的數(shù)量，可以看到自2013年注冊數(shù)量快速上升，標志著基因治療已經(jīng)進入高速發(fā)展階段。

基因編輯技術(shù)的突破推動基因治療的發(fā)展
從上圖看到自2013年基因療法注冊數(shù)量直線上升，這很大程度歸功于基因編輯技術(shù)的突破，特別是2013年第三代基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)被報道。其技術(shù)原理為：DNA雙鏈斷裂會誘導細胞的內(nèi)源性修復機制，通過精確地引入DSB將有助于外源基因的高效整合。目前可精確誘導位點特異性DSB主要有四個系統(tǒng)：鋅指核酸酶( ZFNs )、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)子核酸酶( TALEN )、巨核酸酶，以及最近的CRISPR/Cas9系統(tǒng)（圖6）。


新一代基因編輯技術(shù)的優(yōu)勢
和傳統(tǒng)基因工程中的病毒載體相比，基因編輯技術(shù)提供了一個精準的“手術(shù)剪刀”進行基因的插入，缺失以及糾正，極大地提高了基因編輯的精準性和安全性。目前，利用CRISPR/Cas9基因編輯工具已被廣泛用于臨床基因治療的應(yīng)用，核心的三大基因編輯公司（CRISPR Therapeutics、Editas Medicine和Intellia Therapeutics）也陸續(xù)上市，這些公司致力于基因治療產(chǎn)品的研發(fā)，盡管仍處于早期的發(fā)展階段，但為基因治療的臨床轉(zhuǎn)化開辟了道路。

在過去的一年里，基因治療，尤其在基因組編輯方面取得了一系列突破性的進展，公布了多項臨床試驗的相關(guān)數(shù)據(jù)，證明了基因治療對多種人類嚴重疾病的有效性和安全性，美國第一批基因治療藥物也獲得了FDA的批準。在政府和慈善機構(gòu)的支持下，從事基礎(chǔ)、轉(zhuǎn)化和臨床研究的科學家和臨床醫(yī)生將繼續(xù)創(chuàng)新并開發(fā)更加高效安全的技術(shù)。生物技術(shù)和制藥行業(yè)也越來越多地進軍基因治療領(lǐng)域，體現(xiàn)了這一領(lǐng)域的逐漸成熟，對于促進基因治療的臨床轉(zhuǎn)化是必要的。然而基因治療仍然存在許多挑戰(zhàn)，包括解決整合基因遞送載體或非靶向基因組編輯的遺傳毒性，以及如何將轉(zhuǎn)基因的表達或編輯效率提高到有效的治療水平，解決體內(nèi)載體重復給藥的免疫反應(yīng)等等�；�因療法為人類疾病提供了持久治愈的可能，以過去幾年科研和臨床試驗的成功為例，證明繼續(xù)對基因治療保持樂觀和積極的態(tài)度將有望在將來使這一療法為患者帶來福音。

參考文獻：
[1] Xavier M. Anguela and Katherine A. High. 2019. Entering the Modern Era of Gene Therapy. Annual Review of Medicine. Vol. 70:273-288
[2] Cox, D. B. T. , Platt, R. J. , & Zhang, F. . (2015). Therapeutic genome editing: prospects and challenges. Nature Medicine,21(2), 121-131.
[3] Hacein-Bey-Abina S, Garrigue A, Wang GP, et al. 2008. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J. Clin. Investig. 118:3132–42
[4] Maeder, M. L. , & Gersbach, C. A. . (2016). Genome editing technologies for gene and cell therapy. Molecular Therapy.