前言
今年5月，David R. Liu教授與張鋒教授等人聯(lián)合創(chuàng)立Beam Therapeutics公司，再一次將“單堿基編輯技術”送上了熱搜榜，趁著熱度還未散去，我們繼上一期“單堿基編輯技術淺談”后，又為大家準備了一篇超級實用性的深度分析，帶你一起看看單堿基編輯的前世今生及如何一步步發(fā)展壯大的歷程！希望大家看后能對單堿基編輯技術有一個更全面的認識。


單堿基基因編輯技術（base editors，BEs）
單堿基基因編輯技術，顧名思義，指能在基因組上引起單個堿基改變的基因編輯技術�；�本原理是將胞嘧啶脫氨酶（APOBEC）或腺苷脫氨酶與現(xiàn)存Cas9n(D10A)融合而形成，依賴于CRISPR原理使得靶點遠離PAM端的4-7位的單個堿基發(fā)生修改的基因編輯技術。


目前的單堿基基因編輯包括兩種:
1. CBEs(Cytidine base editors)（圖-1）[1]--嘧啶堿基轉(zhuǎn)換技術（C/G到T/A）:

2. ABEs(Adenine base editors)（圖-2）[2]-嘌呤堿基轉(zhuǎn)換技術（A/T到G/C）:
相對于傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9的優(yōu)勢：
 

	傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9	單堿基編輯技術
編輯效率	細胞：0.1-5%； 胚胎：70%-80%	細胞：70-80%； 胚胎：100%
插入與缺失突變	較高	較低
脫靶效應	較高	較低

單堿基編輯技術工具的發(fā)展及優(yōu)化歷程：

單堿基基因編輯技術自2016年4月被報道以來，迅速成為基因編輯技術領域的一顆璀璨的“明星”。其技術的發(fā)展核心主要是工具的不斷優(yōu)化。下面具體介紹：

第一類：嘧啶堿基轉(zhuǎn)換工具-- CBE (Cytidine base editor)的優(yōu)化歷程
l 2016年4月： David Liu 實驗室首先報道了基于來源于大鼠胞嘧啶脫氨酶與CRISPR/Cas9 融合形成的單堿基基因編輯工具(Cytidine base editors, CBEs)，包括BE1, BE2,BE3。其中在他們實驗室報道的BE3(圖-3)，效率最高，也是目前應用的最為廣泛的嘧啶堿基編輯工具，目前BE3已應用到基因編輯編輯，基因治療，動物模型制作及功能基因篩選等領域。
l 2016年 8月：日本科學家 Keiji Nishida 等將來源于七鰓鰻的胞嘧啶脫氨酶與 CRISPR/Cas9和尿嘧啶糖苷酶抑制劑融合，該系統(tǒng)可在哺乳動物細胞中實現(xiàn) 15%-55%靶向突變[3]。
l 2016年 10月：常興課題組將人源胞嘧啶脫氨酶融合 dCas9 的 C 端 (dCas9-AIDx)形成的TAM(targeted AID-mediated mutagenesis)可通過同樣可在遠離PAM的5-9位產(chǎn)生C到T,A,G的突變[4]。
l 2016年 11月：報道的 CRISPR-X(圖-4)，將來源于人的胞嘧啶脫氨酶突變體去除出核信號后融合到MS2蛋白上，通過 MS2 RNA 的發(fā)夾結(jié)構(gòu)招募到sgRNA 的骨架中，經(jīng)優(yōu)化后的CRISPR-X, 可以引起+20到+40bp 窗口內(nèi)實現(xiàn)平均20.6%的突變效率[5]。

l 2016年 11月：楊璐菡團隊等將TALE, Zinc-finger DNA特異識別單元與來源于人的胞嘧啶脫氨酶進行融合，可在細菌和人的細胞中分別實現(xiàn) 13% 和 2.5%的 C 到 T 的突變效率[6]，這可能是由于胞嘧啶脫氨酶的底物是單鏈DNA, 而 TALE和 Zinc-finger 無法打開雙鏈 DNA從無法使單鏈DNA暴露于胞嘧啶脫氨酶，影響了脫氨酶的效率，進而影響了C 到 T 的轉(zhuǎn)換效率。
l 2017年1 月： 同時David Liu 實驗室也在積極探索不受PAM限制的新型高效的單堿基因組編輯工具， 如VQR-BE3(PAM: NGAN), SaKKH-BE3(NNNRRT)等。 同時，他們也通過胞嘧啶脫氨酶功能域進行氨基酸突變進而篩選到編輯窗口能精確到1-2堿基的單堿基工具，其中以YE1-BE3（W90Y+R126E）為最優(yōu)，保持與BE3相似編輯活性的同時，將編輯窗口精確到1-2個堿基[7]。
l 2018年5 月：上海科技大學陳佳實驗室將Cpf1與胞嘧啶脫氨酶進融合，由于Cpf1特殊結(jié)構(gòu)，無法設計成切口靶向鏈而將非靶向鏈暴露于脫氨酶，因此，最初的Cpf1-Apobec1效率并不高，這一點與TALE-AID類似。但通過將核定位信號引入Cpf1-Apobec1改造為dCpf1-BEs (圖-5)使其工作效率最高可達40%以上[8]，因此，表明NLS的引入在單堿基基因編輯中有著至關重要的作用。

l 通過擴充PAM的CBE，將使CBE工具的使用更加靈活。 但由于CBE固有的原理，即胞嘧啶發(fā)生脫氨基時，隨后將刺激細胞內(nèi)的切除修復，因而在堿基編輯過程中不可避免的產(chǎn)生較低頻的indels及非預期突變（C到G,A的突變），降低了其產(chǎn)物純度。 鑒于此，2017年8月， David Liu 實驗室及陳佳實驗室通過優(yōu)化linker 及UGI的表達量，通過抑制內(nèi)源糖苷酶活性，得到BE4 和eBE-S3(圖-6)均可以不同程度地降低indels及非預期突變，提高其產(chǎn)物純度[9, 10]。


因引，經(jīng)過科學家們對CBE工基礎上進行了深入的挖掘和優(yōu)化，目前的CBE已可以做到較高的編輯效率，較高的產(chǎn)物純度，較精確的編輯窗口，較靈活PAM選擇，這在精確堿基替換方面展示了無可替代的優(yōu)勢。

第二類：嘌呤堿基轉(zhuǎn)換工具--ABEs(Adenine base editors)的優(yōu)化歷程
對于2017年10月報道的嘌呤轉(zhuǎn)換工具-ABEs，它打破了過去單堿基編輯僅能編輯嘧啶堿基的限制。 僅僅過去半年之多， 其已經(jīng)在基因編輯，動物模型制作，基因治療，植物的基因修飾等領域相續(xù)報道。 它的原理與CBE稍有不同，即腺嘌呤脫氨基之后為肌苷，在DNA水平被當作G進行讀碼復制，然而細胞內(nèi)對于肌苷的切除修復并不敏感，因此，ABEs能夠較為高效的產(chǎn)生A/T到G/C的突變，同時維持較高的產(chǎn)物純度。
l 2018年2月： David  Liu 實驗室，考慮到僅有PAM仍然是其使用的一個限制，后來David Liu實驗室將Cas9通過PACE進化得到了不同氨基酸突變的xCas9 （圖-7）其中以xCas9 3.7最優(yōu)， 它不僅NGG PAM與傳統(tǒng)的Cas9保持相當?shù)幕钚�，而且可以，識別 NGA,NGC,NGT, GAA,GAT, 同時保持較低的脫靶效應，這樣可以靶向人類基因組范圍內(nèi)約的1/16的靶點。 之后將其與ABEs 融合，也同樣使ABEs PAM的選擇也更加靈活[11]。

展望ABEs的發(fā)展，就是回首看CBE的發(fā)展。因此，對于ABEs來講，更加靈活的PAM工具的開發(fā)，如 SaKKH(NNNRRT),Cpf1(TTTN) 的融合，也顯得尤為必要。
l 2018年5月： 另外，最近David Liu實驗室,在nature biotechnology報道通過密碼子優(yōu)化后的序列以及引入額外的核定位信號（雙分型）的base editors, 得到BE4max 和ABEmax可以分別提高1.9倍，1.3-7.9倍的堿基編輯效率[13]。
l 2018年 7月：報道了BE-Plus （圖-8），即將多個多肽GCN4與其抗體結(jié)合區(qū)分別融合Cas9n(D10A),Apobec1-UGI, 它可以募集多個拷貝的Apobec1-UGI的融合蛋白，這樣可以在靶點區(qū)3-16位 C/G 到T/C的轉(zhuǎn)變，可實現(xiàn)較大范圍內(nèi)單個堿基突變[12]。類比，將其運用到ABEs當中，也同樣可以實現(xiàn)較大范圍內(nèi)A/T到G/C的突變。

l 2018年7月3日：來自nature biotechnology上最新報道， 也同樣將密碼子優(yōu)化序列（圖-9-1）及核定位序列引入（圖-9-2）到單堿基中BE3中，以FNLS為例（圖-9-3），用慢病毒在較為難轉(zhuǎn)染的細胞中（如NIH3T3細胞）最高提高了約50倍的C到T 的突變（相對于BE3）（圖-9-2），使應用更加廣泛[14]。這些優(yōu)化將促使單堿基基因編輯工具更加高效，靈活，通用。






單堿基編輯技術的應用
點突變是引起人類遺傳病的主要原因之一。據(jù) ClinVar database顯示，C/G 到 T/A, A/T 到 G/C突變引起致病單核苷酸突變的分別占48%，14% （圖-10）。


也即是，這兩種類型的突變將極大可能被ABE或CBE進行較正。因此，未來兩種高效靈活的單堿基工具將會在未來的基因治療中大顯身手。如β-血紅蛋白病， 它主要由于在成年人中β-globin基因突變導致功能異常所致。 目前已證實 高水平表達胎兒血紅蛋白（HbF）病被認為治療β-血紅蛋白病的很有潛力的策略[15]。-198 T > C[16], -175 T > C[17]這些在β-globin的啟動區(qū)的突變可以通過不同的機制提高 HbF的表達。而這些突變已被報道可以被單堿基工具ABE7.10高效編輯[2, 13]。因此，未來利用單堿基治療β-血紅蛋白�。ㄈ绲刂泻Ｘ氀�）將極有可能是一個絕佳的策略。

雖然，CBE或ABE單堿基編輯技術具有其強大的優(yōu)勢，但是離未來臨床疾病治療仍然還有很多問題需要解決。
1. 主要是以下幾點：如CBE，ABE體積都過大，在基因治療中需要進行有效拆分后包裝進AAV進行體內(nèi)治療；
2. 典型的CBE,ABE 高效編輯窗口依然是4-7位， 是否可將實現(xiàn)窗口平移，以靶向基因組更為廣闊的空間也有待進一步研究；
3. CBE可以通過突變胞嘧啶脫氨酶特定位點從而實現(xiàn)更加精確的1-2位的編輯窗口，而相對ABE的窗口最為精確也只能為4-7位，能否進一步通過突變腺嘌呤脫氨酶特定位點從而實現(xiàn)更加精確的ABE的編輯窗口，有待進一步研究。
4. 在CBE，ABE中雖然均能高效地編輯某些靶點，但并非所有靶點均能編輯，其高效靶點是否存在某種規(guī)律？是否也Cas9中靶點的選擇存在某種關系，也有待研究。
5. 目前已經(jīng)實現(xiàn)嘧啶與嘧啶，嘌呤與嘌呤之間互換，是否存在嘧啶與嘌呤之間的堿基互換，也有待進一步研究；
6. 目前，Cas9蛋白結(jié)構(gòu)已知，胞嘧啶脫氨酶（APOBEC）或腺苷脫氨酶的蛋白結(jié)構(gòu)也未知，融合成相應的CBE,ABE結(jié)構(gòu)也未知，因此，未來解析CBE,ABE的融合蛋白結(jié)構(gòu)深入理解單堿基編輯靶向識別與編輯機制，也意義重大。

參考文獻：
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