作者：Nadia Tagnaouti1 , Anitha Thomas1 , Rebecca De Souza1 , Ian Backstorm1 , Andrew Brown1 , Eric Ouellet1 , Shyam Garg1 , Grace Tharmarajah1 , Keara Marshall1 , Shannon Chang1 , Timothy Leaver1 , Andre Wild1 , Oscar Seira2,3, Jie Liu2,3, Wolfram Tetzlaff2,3, Peter Deng4,5 , David J. Segal5 , Jan A. Nolta4 , Kyle D. Fink4 , R. James Taylor1 and Euan Ramsay1
1 Precision NanoSystems Inc., Vancouver, BC, Canada, 2 International Collaboration on Repair Discoveries (ICORD), 3 Department of Zoology, 4 Stem Cell Program and Institute for Regenerative Cures, University of California Davis Health Systems, Sacramento, CA, USA, 5 Genome Center, MIND Institute, and Biochemistry and Molecular Medicine, University of California, Davis, CA, USA

       近年來，對一種能夠在體內(nèi)和體外傳遞有效載荷以調(diào)節(jié)基因表達(dá)的高效傳遞工具的需求一直在穩(wěn)步增長。脂質(zhì)納米粒(LNPs)利用協(xié)同載脂蛋白E (apoE)的單劑量傳遞途徑，通過低密度脂蛋白受體(LDLR)介導(dǎo)包裹核酸的有效傳遞。然而，它們從實驗臺到臨床的應(yīng)用都受到了相當(dāng)大的限制，因為在制造過程中遇到了大大小小的挑戰(zhàn)。在這里，我們通過描述脂質(zhì)納米顆粒的穩(wěn)健制造和使用來彌補(bǔ)這一差距。我們使用優(yōu)化的微流體平臺，高效地將核酸(如siRNA、mRNA、質(zhì)粒DNA)以適合管理的規(guī)模，在體外難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和動物模型中進(jìn)行包裝和遞送。
在這里，我們提供了這些LNPs在初級皮質(zhì)大鼠neu- rons中高效細(xì)胞攝取的證據(jù)，以及它們傳遞核酸有效載荷的能力，這些能力允許:通過siRNA介導(dǎo)的降解下調(diào)靶向mRNA，表達(dá)外源性mRNA序列，以及外源性表達(dá)克隆到質(zhì)粒中的基因。這些LNPs能夠達(dá)到高轉(zhuǎn)化率的效率，沒有可測量的相關(guān)毒性。我們還提供了初步的數(shù)據(jù)，詳細(xì)說明了在紋狀體注射后使用質(zhì)粒DNA-LNPs在體內(nèi)表達(dá)基因的效率
       總的來說，這些研究為建立有效地將小(siRNA)和大核酸(mRNA，質(zhì)粒DNA)傳遞給原始細(xì)胞用于治療的策略提供了有價值的見解。在此基礎(chǔ)上，我們通過優(yōu)化LNP傳遞方法，為高效傳遞CRISPR-Cas9系統(tǒng)的導(dǎo)RNA和表達(dá)Cas9提供了一個合適的框架。

通過脂質(zhì)納米顆粒傳遞基因
       脂質(zhì)納米粒(LNPs)是一個平臺，可以用來傳遞核酸到細(xì)胞。LNPs模擬低密度脂蛋白(LDLs)，由內(nèi)源性途徑攝取。LNPs對pH值敏感，其設(shè)計目的是將其有效載荷釋放到細(xì)胞質(zhì)中。

體外環(huán)境

   

 1.NanoAssemblr^TMSpark反應(yīng)器   2.吸取RNA和Neuro9溶液  3.插入Spark,點(diǎn)擊“開始”4.吸出加到細(xì)胞里

體內(nèi)環(huán)境

   

1.準(zhǔn)備核酸溶液解凍Neuro9混合液 裝入單獨(dú)的注射器
2.把注射器放入NanoAssemblr Benchtop ,運(yùn)行程序3min
3.用離心過濾或透析凈化
4.直接注射或全身給藥

Methods

1、原代大鼠皮層神經(jīng)元培養(yǎng)
       E18大鼠皮質(zhì)組織購自BrainBits, LLC.，將皮質(zhì)從運(yùn)輸介質(zhì)中取出，用0.25%的色氨酸進(jìn)行色氨酸染色trypsin-EDTA (ThermoFisher)。然后在DMEM (ThermoFisher)中用10%的FBS洗滌組織，使胰蛋白酶- eda失活，其次是DMEM。組織在神經(jīng)介質(zhì)(NeuroCult™Neuronal base Medium (StemCell))和NeuroCult™中研磨，SM1神經(jīng)元補(bǔ)體(干細(xì)胞)和l -谷氨酰胺(干細(xì)胞)補(bǔ)充l -谷氨酸(Sigma)，然后通過40μm細(xì)胞形成一個細(xì)胞懸液過濾器。然后將該懸浮液計數(shù)并鍍在PDL涂層培養(yǎng)板或玻璃上，密度為4.8 x 104個細(xì)胞/平方厘米。每3-4天，一半的介質(zhì)用不含L-谷氨酸的神經(jīng)元介質(zhì)更換一次。
2、LNPs治療大鼠原代皮層神經(jīng)元
       7天后(DIV7) 5µg /ml的ApoE在指定劑量的LNP被添加。然后神經(jīng)元孵育48小時后收獲，進(jìn)行終點(diǎn)評估。
3、流式細(xì)胞儀
      用上述指定的LNP處理和孵育后，用PBS沖洗神經(jīng)元，然后用0.25%的胰蛋白酶- edta色氨酸處理將它們從培養(yǎng)皿中分離出來。用3% FBS滅活PBS中的胰蛋白酶，使神經(jīng)元失活
      三聚體形成單細(xì)胞懸浮體然后用PBS將神經(jīng)元球團(tuán)洗凈，再懸浮于懸浮液中加入緩沖液(BD biosciences)和碘丙鈉(BD biosceinces)對凋亡細(xì)胞進(jìn)行染色。懸浮的染色神經(jīng)元然后通過35μm細(xì)胞過濾器,然后加入使用BDCelesta 流式細(xì)胞分析儀。
4、可行性分析
      根據(jù)制造商的說明，PrestoBlue®細(xì)胞活性試劑(ThermoFisher)中包含的標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議，值被校準(zhǔn)到含有不含神經(jīng)元介質(zhì)的介質(zhì)管中。
5、免疫細(xì)胞化學(xué)
      在此評估中，將神經(jīng)元置于涂有PDL涂層的蓋玻片上，然后進(jìn)行培養(yǎng)、處理和孵育，用PBS洗滌，4% PFA固定神經(jīng)元，用0.1% trton - x對神經(jīng)元進(jìn)行滲透，然后用NDS阻斷，然后用MAP2抗體(Sigma M4403)孵育1小時。然后在NGS中阻斷神經(jīng)元，然后進(jìn)行孵育與GFP抗體(AbCam ab13970)在NGS過夜。然后加入二級抗體，AlexaFluor-594用于MAP2和alexafluor GFP - 488。蓋玻片安裝在玻璃載玻片上使用extended®鉆石防褪色貼片(Thermofisher)，在共焦顯微鏡上成像。通過實驗證實了第一和第二抗體的選擇性結(jié)合沒有主控件(數(shù)據(jù)未顯示)
6、RNA提取和RT-qPCR
      在對神經(jīng)元進(jìn)行處理和孵育后，使用PureLink®RNA Mini Kit RNA提取試劑盒預(yù)成型RNA提取(hermoFishe)按照制造商的說明。使用NanoDrop (ThermoFisher)進(jìn)行RNA濃度測定和然后使用相同數(shù)量的RNA進(jìn)行cDNA轉(zhuǎn)換，使用 SuperScript IV VILO Master Mix (ThermoFisher) 說明書指導(dǎo)。采用TaqMan引物和探針對目標(biāo)mRNA和從IDT獲得ActB進(jìn)行RT-qPCR， iTaq Universal Probes Supermix master mix (BioRad)，在BioRad CFX96運(yùn)行熱循環(huán)(BioRad)，每個PCR三個重復(fù)。使用∆∆Ct方法將靶mRNA的表達(dá)值歸一化為ActB值。

mRNA在大鼠原代神經(jīng)元中的傳遞

注：MAP2陽性神經(jīng)元(紅色)經(jīng)Neuro9 GFP mRNA-LNP 5µg /毫升ApoE的處理后表達(dá)GFP(綠色).胞用抗map2一抗/alexa fluor-594偶聯(lián)二抗和抗GFP一抗/alexa fluor-488偶聯(lián)二抗染色.核用DAPI染色(藍(lán)色)

    大鼠原代神經(jīng)元在5µg /mLApoE存在的情況下經(jīng)過Neuro9 GFP mRNA-LNP處理48 h后，流式細(xì)胞儀分析DIV 7,顯示> 95%的神經(jīng)元吸收了LNP(計算使用納米顆粒內(nèi)的熒光探針并encorporated)即使在不同的治療劑量的GFP mRNA LNP使用(數(shù)據(jù)沒有顯示)。

1. 的百分比GFP+神經(jīng)元呈劑量依賴性，其中1 ug/mL的比例最高。
2. 平均熒光強(qiáng)度(MFI)最高的GFP mRNA劑量1µg / mL,每個處理n = 3,單向方差分析與Dunnett多個比較測試,* * p < 0.005, p < 0.05

3. 使用PrestoBlue®細(xì)胞活力試劑檢測細(xì)胞活力。在使用任何劑量時均未觀察到毒性，n=6為每個治療的單因素方差分析(Dunnett’s multiple)比較測試
4. 封裝不同mRNA的納米顆粒的尺寸和多分散性指數(shù)(PDI)具有可比性。GFP mRNA全長996個核苷酸，Cas9 mRNA全長4479個核苷酸長度。盡管使用不同長度的mRNA，但粒徑和PDI沒有顯著差異,學(xué)生測試

質(zhì)粒在大鼠原代神經(jīng)元中的傳遞
        MAP2陽性神經(jīng)元(紅色)經(jīng)Neuro9 GFP處理后表達(dá)GFP(綠色)plasmid-LNP 5µg /毫升ApoE的存在，細(xì)胞用抗map2一抗/alexa fluor-594偶聯(lián)二抗和抗gfp一抗/alexa fluor-488偶聯(lián)二抗染色，核用DAPI染色(藍(lán)色)
       流式細(xì)胞儀分析在Neuro9 GFP  plasmid-LNP存在下治療48 h后的情況5µg /毫升ApoE在鼠初級神經(jīng)元,DIV 7,顯示> 95%的神經(jīng)元表現(xiàn)出lnp的吸收(用熒光探針計算，納米顆粒內(nèi)確實有包裹)用不同劑量的GFP質(zhì)粒處理(數(shù)據(jù)未顯示)

1. GFP neruons呈劑量依賴性，其中0.6ug/mL的比例最高。
2. 在GFP MFI中也觀察到這種劑量反應(yīng)模式，n=3表示每次治療的單因素方差分析Dunnett's多重比較檢驗，**** p<0.0001， ** p<0.005

3. 使用PrestoBlue®細(xì)胞活力試劑檢測細(xì)胞活力。任何劑量均未觀察到毒性，每次治療n=6，單因素方差分析與Dunnett’s倍數(shù)比較測試
4. 包覆不同質(zhì)粒的納米顆粒大小和PDI具有可比性。盡管使用不同大小的質(zhì)粒，顆粒大小和PDI沒有顯著差異，學(xué)生的t-test

質(zhì)粒在體內(nèi)的傳遞
        10個月大的FVB小鼠，皮下注射GFP plasmid-LNP，48H后GFP表達(dá)(綠色)。注入5μl 3mg/ml GFP plasmid-LNP。用DAPI染色(藍(lán)色)細(xì)胞核，用DiD染色(紅色)的LNP，GFP表達(dá)(綠色)在相同的區(qū)域上。LNP的攝取和GFP的表達(dá)均在注射區(qū)域內(nèi)定位紋狀體，并已擴(kuò)散到包括心室部分在內(nèi)的周圍增生性區(qū)域系統(tǒng)和胼胝體。

小RNA在大鼠原代神經(jīng)元中的傳遞 A)使用Neuro9 siRNA-LNP處理48 h后流式細(xì)胞術(shù)分析，5µg /毫升ApoE存在鼠主要神經(jīng)元中,DIV 7,顯示> 95%的神經(jīng)元顯示吸收的脂質(zhì)納米顆粒(使用熒光探針計算納米顆粒內(nèi)的包殼)
B)使用PrestoBlue®細(xì)胞活力試劑檢測細(xì)胞活力。在有效劑量為5倍的情況下，未觀察到毒性，采用單因素方差分析和 Dunnett’s 多重比較試驗。
C) siRNA LNP劑量在1µg /ml的產(chǎn)品，同時使用IDT和Dharmacon的siRNAs，靶向mRNA75%擊倒，每個處理n=3，與Dunnett的單因素方差分析多重比較檢驗，**** p<0.0005。
D) C) 封裝不同siRNA的納米顆粒的大小和PDI 比較，盡管使用不同大小的siRNAs，但顆粒大小和PDI沒有顯著差異。

結(jié)論

1. NanoAssembly™平臺能夠創(chuàng)建攜帶siRNA、mRNA或質(zhì)粒有效載體高度可重現(xiàn)性的LNPs
2. 這些LNPs在原代、大鼠、皮層神經(jīng)元可以有效地傳遞（>95%），并且允許相關(guān)的payloads高效傳遞
3. 即使在高劑量時，LNPs對這些初級神經(jīng)元也沒有毒性(50x)

      我們的研究結(jié)果證實，這些脂質(zhì)納米�？梢宰鳛橐环NCRISPR-Cas9組分到介導(dǎo)基因的有效的傳遞系統(tǒng)使用

LNP-mediated CRISPR-Cas9傳遞
LNPs具有多種功能，可以通過mRNA、pDNA或預(yù)先形成的核糖體蛋白復(fù)合物來傳遞Cas，一個或多個導(dǎo)向股也可以很好傳遞

實驗儀器：

NanoAssemblr^TMSpark納米顆粒合成系統(tǒng)  （點(diǎn)擊此處打開產(chǎn)品鏈接）

 

NanoAssemblr Benchtop納米顆粒合成系統(tǒng) （點(diǎn)擊此處打開產(chǎn)品鏈接）