【背景】

 

成骨腫瘤（osteogenic tumor）是骨組織最常見的原發(fā)性腫瘤，包括良性骨形成腫瘤、骨瘤、成骨細(xì)胞瘤和惡性腫瘤（又稱為成骨源性肉瘤或骨肉瘤）。骨肉瘤主要在兒童和青少年人群中高發(fā)，老年人位列第二發(fā)病率高峰。由于傳統(tǒng)化療生存效益不理想，因此預(yù)后較差，當(dāng)前迫切需要更多針對性和個性化的治療骨肉瘤的方法。

 

越來越多證據(jù)表明，小鼠模型可以概括人類骨肉瘤的基本方面，并提供靶向治療目標(biāo)。利用轉(zhuǎn)基因小鼠或基因敲除小鼠模擬人類癌癥已經(jīng)被證明可以顯著地加深我們對腫瘤形成的確切細(xì)胞來源以及信號通路的理解。

 

以往的研究表明，p53和/或Rb基因突變以及其他成員參與鼠模型和人類骨肉瘤患者起源，破壞間充質(zhì)祖細(xì)胞（Prx1-cre）、成骨細(xì)胞前體細(xì)胞（Osx-Cre）和成骨細(xì)胞定向細(xì)胞（Col1a1-Cre和OCN-Cre）的p53/Rb，可以導(dǎo)致骨肉瘤，間接證明間充質(zhì)起源和成骨譜系細(xì)胞對成骨腫瘤的形成負(fù)責(zé)，另外，定向成骨細(xì)胞（Col1a1-Cre）的NOTCH激活足以誘導(dǎo)骨肉瘤說明定向成骨細(xì)胞可能是成骨腫瘤的一個潛在來源。然而，對不同亞型的基因突變的確切細(xì)胞起源仍有待描述。

 

LKB1，由Stk11編碼，主要通過mTORC1途徑控制關(guān)聯(lián)能量動態(tài)平衡和細(xì)胞生長的絲氨酸/蘇氨酸激酶。缺失LKB1可引起增生和腫瘤。LKB1失活的癌癥往往表現(xiàn)出侵襲性，對治療的敏感性與LKB1未失活的癌癥不同。LKB1可能與骨癌有關(guān)。最近的一項研究表明，41%骨肉瘤患者LKB1蛋白表達(dá)下降，大多數(shù)患者的mTORC1激活。雖然認(rèn)為LKB1丟失與成骨腫瘤有關(guān)，但相關(guān)的細(xì)胞類型和潛在途徑尚不清楚。

 

組織蛋白酶K（Cathepsin K，Ctsk）是一種由破骨細(xì)胞分泌的半胱氨酸蛋白酶，對骨吸收過程中的基質(zhì)膠原的降解至關(guān)重要。Ctsk啟動子僅對破骨細(xì)胞有活性，Ctsk-Cre小鼠被廣泛用于破骨細(xì)胞功能研究，最近一項研究指出，當(dāng)刪除Ctsk-Cre細(xì)胞的Ptpn11，Ctsk-Cre可以是軟骨細(xì)胞祖細(xì)胞，通過激活Hedgehog信號導(dǎo)致混合性軟骨瘤病。刪除軟骨細(xì)胞Lkb1（Col2a1-Cre）導(dǎo)致骨骼生長板顯著破壞以及軟骨腫瘤形成，Ctsk-Cre細(xì)胞的Lkb1缺失可導(dǎo)致軟骨腫瘤。

 

【方法和結(jié)果】

 

有趣的是，新研究發(fā)現(xiàn)，Ctsk-Cre細(xì)胞的Lkb1缺失導(dǎo)致了成骨源性腫瘤樣表型，而并非軟骨腫瘤。譜系追蹤表明，Ctsk-Cre可標(biāo)記為骨膜源性細(xì)胞群，根據(jù)標(biāo)志和功能特性可定義為間充質(zhì)祖細(xì)胞，換句話說，Ctsk-Cre細(xì)胞可以作為軟骨腫瘤和成骨腫瘤在不同信號調(diào)節(jié)作用下的祖細(xì)胞。其中，mTORC1抑制劑具有治療骨肉瘤的潛力。

 

這項研究發(fā)現(xiàn)了成骨腫瘤的一個新細(xì)胞起源，并指出Lkb1在原發(fā)性骨腫瘤中充當(dāng)腫瘤抑制因子的角色，從而提高了我們對兩種細(xì)胞的認(rèn)識。成果發(fā)表在《The Journal of Clinical Investigation》（最新影響因子13.251），題為“Lkb1 deletion in periosteal mesenchymal progenitors induces osteogenic tumors through mTORC1 activation”。

 

Ctsk-Cre細(xì)胞的Lkb1缺陷可引起成骨腫瘤樣腫瘤表型

 

為了調(diào)查Lkb1在Ctsk-Cre細(xì)胞中的作用，研究人員分別構(gòu)建了Ctsk-Cre小鼠和Ctsk-CKO小鼠，缺乏Lkb1的軟骨細(xì)胞系（Col2a1-Cre）。由于Ctsk-Cre細(xì)胞被認(rèn)為是間軟骨瘤（metachondroma）的來源，推測缺乏Lkb1的Ctsk⁺細(xì)胞會導(dǎo)致軟骨癌。然而，令人驚奇的是，Ctsk-CKO小鼠并未表現(xiàn)出軟骨癌，反而呈現(xiàn)出一種特殊的骨骼表型。KO鼠在13周齡以前表現(xiàn)為過度生長，13周后體重下降。85%的KO鼠死于30周齡前。

 

Ctsk⁺細(xì)胞缺乏Lkb1，致密骨腫瘤樣聚集，與細(xì)胞周期有關(guān)的基因（包括Ccnd1、Cdkn1a、Cdkn2a和Cdkn2b）顯著增加，Ctsk-CKO小鼠骨肉瘤原癌基因Mdm2和Notch靶向基因Hey1表達(dá)升高，它們在骨肉瘤患者和小鼠模型中同樣頻繁上調(diào)。相反，Rb和Bub3等抑癌基因表達(dá)下調(diào)（圖1）。

 

 

 

圖1. Ctsk-Cre細(xì)胞的Lkb1缺陷可引起成骨腫瘤樣腫瘤表型

 

之后，研究人員將Ctsk-CKO小鼠與對照小鼠（Ctsk-Ctrl）進(jìn)行比較，定量微量 X射線斷層掃描和RT-qPCR結(jié)果表明，致密骨厚度和異位骨形成增加，但骨體積和組織體積百分比下降，前成骨細(xì)胞標(biāo)記Alp和Col1a1特異性增加，Ctsk-CKO小鼠骨形成激活，根據(jù)觀察到的成骨細(xì)胞活性增加，腫瘤主要由成骨細(xì)胞組成（圖2）。

 

 

圖2. 敲除Ctsk-Cre細(xì)胞的Lkb1導(dǎo)致骨形成增加

 

破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的Lkb1缺陷不會誘導(dǎo)成骨腫瘤樣表型

 

破骨細(xì)胞抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色發(fā)現(xiàn)，Ctsk-CKO小鼠的骨膜、骨內(nèi)膜和松質(zhì)骨的破骨細(xì)胞數(shù)量增加。研究人員還利用Ctsk-CKO和Ctsk-Ctrl小鼠的骨髓細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞。TRAP活性定量顯示，來自Ctsk-CKO骨髓細(xì)胞的破骨細(xì)胞形成增加（圖3），說明Ctsk-CKO小鼠的骨量增加并非因為再吸收受損。其他實驗排除了Ctsk-CKO小鼠的成骨腫瘤樣表型與破骨細(xì)胞功能改變有關(guān)。

 

 

圖3. 破骨細(xì)胞前體細(xì)胞缺失Lkb1不會造成成骨腫瘤樣表型

 

Ctsk-Cre成骨間充質(zhì)細(xì)胞是成骨腫瘤的潛在來源

 

細(xì)胞譜系追蹤顯示Ctsk-Cre陽性LysM-Cre陰性細(xì)胞群位于致密骨的骨膜內(nèi)（圖4）。隨著年齡增長，Ctsk-CKO小鼠的Ctsk-Cre陽性細(xì)胞不斷擴(kuò)張?zhí)顫M了脛骨的致密骨。20周齡前，GFP陽性細(xì)胞形成脛骨Ctsk-CKO小鼠的骨樣腫瘤，暗示成骨腫瘤來自LKB1缺失本身。

 

 

圖4. Ctsk-Cre骨膜間充質(zhì)干細(xì)胞是成骨腫瘤的新型潛在來源

 

接著研究人員分析了Ctsk⁺細(xì)胞的通用干細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Sca1、CD24、CD44、CD49f 和CD146都有表達(dá)。隨后采用賽業(yè)生物（Cyagen）干細(xì)胞定向誘導(dǎo)技術(shù)，體外觀察骨膜Ctsk⁺細(xì)胞的分化潛能，證明它們可以分化為成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，以及表達(dá)相應(yīng)的分化標(biāo)志物。換句話說，Ctsk可定義為一群間充質(zhì)干細(xì)胞。

 

LKB1抑制Ctsk⁺骨膜間充質(zhì)干細(xì)胞的自我更新和成骨分化能力

 

鑒于Ctsk⁺骨膜間充質(zhì)干細(xì)胞的角色，這項研究首次發(fā)現(xiàn)Lkb1可以抑制這些細(xì)胞的自我更新能力以及成骨分化能力。

 

為了驗證，Lkb1缺陷是否足以驅(qū)動正常小鼠的成骨腫瘤形成。研究人員分別將對照小鼠和Ctsk-CKO的骨膜源性細(xì)胞進(jìn)行裸鼠皮下注射移植。8周后，HE染色和共聚焦成像顯示，Ctsk-CKO組骨樣基質(zhì)的細(xì)胞和核表現(xiàn)出腫瘤異型性和腫瘤形成特征。

 

隨后，抑制mTORC1信號可以改善Ctsk-CKO小鼠腫瘤進(jìn)展，并阻止異種移植模型的腫瘤生成

 

【總結(jié)】

 

本研究證明了骨膜Ctsk⁺細(xì)胞的LKB1缺失導(dǎo)致成骨腫瘤樣表型，介導(dǎo)途徑為mTORC1的活動增加，澄清了Lkb1在人類骨肉瘤生成中的作用。此外，擴(kuò)展了Ctsk⁺細(xì)胞的定義，即它們不僅是一類新型骨膜間充質(zhì)祖細(xì)胞，而且還是骨肉瘤的來源。

 

骨髓瘤治療可以靶向多條通路的聯(lián)合療法以期取得協(xié)同效應(yīng)，例如，理論上采用雷帕霉素結(jié)合抗VEGF療法，治療LKB1損傷的骨肉瘤患者。LysM⁺細(xì)胞缺失Lkb1后不會導(dǎo)致致密骨腫瘤形成，說明破骨細(xì)胞沒有參與Lkb1相關(guān)骨肉瘤發(fā)病機(jī)理。而實際上，Ctsk-CKO和LysM-CKO小鼠都表現(xiàn)出破骨細(xì)胞形成（圖3），Ctsk-CKO小鼠富含大量破骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞前體細(xì)胞，意味著Lkb1可能在破骨細(xì)胞生成方面起到一定作用，未來，研究人員準(zhǔn)備進(jìn)一步調(diào)查Lkb1影響破骨細(xì)胞生成的具體角色。

 

原文檢索：Lkb1 deletion in periosteal mesenchymal progenitors induces osteogenic tumors through mTORC1 activation