國自然沖刺：打通菌群多樣性與功能的研究策略
近幾年，腸道微生物可以說是最熱的研究熱點，頻繁登上在CNS期刊的封面，不僅相關主題的學術論文表現(xiàn)強勢，而且國自然資助的腸道微生物項目數(shù)也呈顯著增長的趨勢，其中2018年一共資助了近180項研究，資助金額高達7600萬。由此可見腸道微生物一直是科研領域的研究熱點，相信2019年腸道微生物仍是國自然申請的熱點。總之，緊跟這個熱點，不僅容易發(fā)文、發(fā)好文，申請基金也更加容易。
現(xiàn)有常用研究策略的不足
16S測序或宏基因是最常用的腸道微生物研究手段，主要側重研究腸道微生物的多樣性與生理、疾病之間的相關性。盡管這樣的研究方法能夠有助于了解生物過程中的菌群遷移情況以及找出潛在的參與疾病發(fā)生的菌株，在此基礎上可進一步借助動物模型采用糞便移植或者特定菌株的灌胃實驗等技術，可以相對直接地揭示腸道微生物或特定菌株與疾病之間的因果關系，但是對菌的功能與作用機制卻知之甚少，也就是說僅僅采用16S測序或宏基因測序難以實現(xiàn)對菌群功能的探究。因此，從國自然申請標書的研究方案完整性與創(chuàng)新性上來看，這是需要大家關注的問題。
腸道菌群功能研究的切入點
目前大量研究發(fā)現(xiàn)腸道微生物對食物或外源性物質代謝過程中產(chǎn)生的一些小分子是有功能和活性的，如SCFAs，膽汁酸，TMA/TMAO，神經(jīng)遞質，氨基酸等物質對腸上皮組織乃至整個機體的物質代謝、免疫調節(jié)以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調節(jié)發(fā)揮著重要的作用。腸道菌群正是通過這些活性小分子與宿主進行相互作用的。因此為了更好的理解腸道微生物-宿主之間的相互作用關系，不僅需要了解腸道菌群的多樣性變化，還需要進一步研究腸道菌群功能的變化，即對腸道菌群代謝產(chǎn)物的變化進行研究。所以如果從代謝物作為菌群功能研究的切入角度，相信會給申請國自然的項目的完整性、創(chuàng)新性加分不少。
打通多樣性+功能的研究策略——16S+代謝組
菌群的多樣性分析最常用的方法是采用16S rDNA擴增子測序方法（以下簡稱16S），其低成本快速高效，且方法成熟。而菌群功能則可以通過代謝組學對菌群相關的代謝產(chǎn)物進行系統(tǒng)性地檢測。代謝組學是基于高通量分析和生物信息學技術，一種用于研究內源性小分子的組學技術，能夠客觀地檢測菌群代謝產(chǎn)物，清晰的反映腸道菌群“功能”在特定條件下的變化。（如果前期沒有關注特別關注的代謝物，可以選擇非靶向代謝組學進行大規(guī)模篩選，如果有特定關注的代謝物，則可以選擇靶向代謝組學。）16S與代謝組學相結合，打通腸道群菌“多樣性”與“功能”，是最具有生物學聯(lián)系的兩個層面的聯(lián)合，有助于全面探索腸道菌群與疾病發(fā)生、藥物代謝/藥效關系。
正是因為16S+代謝能夠研究得更加深入和完整，所以近2年不少高水平文章都是采用這樣的研究套路，甚至還有不少文章僅是補了個代謝實驗，拿以前16S的數(shù)據(jù)又再發(fā)表了一篇文章。
16S+代謝聯(lián)合分析的關鍵——代謝組學
16S+代謝聯(lián)合分析能否做得好，更關鍵的可能在代謝組實驗。16S是基于測序技術，起步早，方法成熟，不同平臺的檢測能力、數(shù)據(jù)質量相對接近，在這里不做過多討論。與16S 不同，代謝組學發(fā)展最晚，有一定特殊性，遠比轉錄組、蛋白組更復雜，比如說鑒定、質量控制都存在很多難點。不同平臺的分析能力差異還是非常大的。
● 從鑒定來說，代謝組無法像測序一樣做拼接，也無法像蛋白組一樣通過公共數(shù)據(jù)庫直接解決鑒定問題。代謝物存在大量的同分異構體和分子質量相近的物質，因此如果通過分子質量去檢索公共數(shù)據(jù)庫往往會匹配到多個代謝物，這樣的結果毫無意義。那代謝物究竟是怎么去做鑒定的呢？當儀器型號和參數(shù)固定了，代謝物碎裂形成的二級譜圖也就固定了，但可避免的也會出現(xiàn)碎裂圖譜相似的代謝物干擾匹配結果，所以一般還需要經(jīng)驗豐富的實驗人員進行人工二次確認。正是因為代謝物有這樣的特點，目前代謝物的精確鑒定是非常依賴于本地標品自建數(shù)據(jù)庫+人工二次確認，也是決定不同分析平臺鑒定結果可靠性的重要判斷依據(jù)。
● 從質控來說，代謝個體化差異大，所以樣本數(shù)量比其他組學要求多，因此實驗穩(wěn)定性是很關鍵的考察點，發(fā)文章也是需要展示質控結果的，同樣的，在考量不同分析平臺的時候質控也應該是非常重要的一項內容，不要忽視。
如何進行16S+代謝組學的聯(lián)合分析
關聯(lián)分析是數(shù)據(jù)深入挖掘的一種方式，主要用來發(fā)現(xiàn)隱藏在數(shù)據(jù)集中的關聯(lián)性或相關性。目前16S+代謝組學的聯(lián)合分析分為三步：
第一步：分別對16S和代謝組的數(shù)據(jù)進行分析，篩選顯著性差異菌群與顯著性差異代謝物。
第二步：基于Spearman或Pearson統(tǒng)計學分析方法對顯著性差異菌群與顯著性差異代謝物進行相關性計算。相關性系數(shù)越大，表明對應的菌與代謝物之間的相關性越強。
第三步：借助網(wǎng)絡圖、層次聚類熱圖等可視化方法，從多個角度對相關性計算結果進行展示和挖掘，篩選引起代謝變化的關鍵菌株。
總 結
綜上所述，16S+代謝的研究策略彌補了目前16S或宏基因對功能研究的缺失，是最具生物學意義的兩個組學關聯(lián)，打通了菌群多樣性與功能，借助相關性分析，可以對關鍵菌株及其功能進行挖掘，能夠把文章故事講的更深、更完整、更創(chuàng)新。代謝組學發(fā)展較晚，是聯(lián)合分析的關鍵，如果代謝組學數(shù)據(jù)質量存在問題是會影響聯(lián)合分析數(shù)據(jù)挖掘。
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