實驗原理：

轉(zhuǎn)染是將外源性基因?qū)�入�?xì)胞內(nèi)的一種專門技術(shù)。隨著基因與蛋白功能研究的深入，轉(zhuǎn)染目前已成為實驗室工作中經(jīng)常涉及的基本方法。

常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為兩大類,一類是瞬時轉(zhuǎn)染,一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（永久轉(zhuǎn)染）。前者外源 DNA /RNA不整合到宿主染色體中,因此一個宿主細(xì)胞中可存在多個拷貝數(shù),產(chǎn)生高水平的表達(dá),但通常只持續(xù)幾天,多用于啟動子和其它調(diào)控元件的分析。一般來說，超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后24-72小時內(nèi)（依賴于各種不同的構(gòu)建）分析結(jié)果，常常用到一些報告系統(tǒng)如熒光蛋白，β半乳糖苷酶等來幫助檢測。后者也稱穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。盡管線性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整合率高，外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合，通常需要通過一些選擇性標(biāo)記，如來氨丙基轉(zhuǎn)移酶（APH；新霉素抗性基因）、潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPH）、胸苷激酶（TK）等反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。

轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導(dǎo)、化學(xué)介導(dǎo)和生物介導(dǎo)三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因槍屬于通過物理方法將基因?qū)�入�?xì)胞的范例；化學(xué)介導(dǎo)方法很多，如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、和多種陽離子物質(zhì)介導(dǎo)的技術(shù)；生物介導(dǎo)方法，有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染，和現(xiàn)在比較多見的各種病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)。

理想細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性小等優(yōu)點。病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，是目前轉(zhuǎn)染效率最高的方法，同時具有細(xì)胞毒性很低的優(yōu)勢。但是，病毒轉(zhuǎn)染方法的準(zhǔn)備程序復(fù)雜，常常對細(xì)胞類型有很強的選擇性，在一般實驗室中很難普及。其它物理和化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，則各有其特點。

需要指出的一點，無論采用哪種轉(zhuǎn)染技術(shù)，要獲得最優(yōu)的轉(zhuǎn)染結(jié)果，可能都需要對轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化。影響轉(zhuǎn)染效率的因素很多，從細(xì)胞類型、細(xì)胞培養(yǎng)條件和細(xì)胞生長狀態(tài)，到轉(zhuǎn)染方法的操作細(xì)節(jié)，都需要考慮。

常見的轉(zhuǎn)染方法及比較

轉(zhuǎn)染技術(shù)的選擇對轉(zhuǎn)染結(jié)果影響也很大，許多轉(zhuǎn)染方法需要優(yōu)化DNA與轉(zhuǎn)染試劑比例、細(xì)胞數(shù)量、培養(yǎng)及檢測時間等。一些傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，如DEAE右旋糖苷法、磷酸鈣法、電穿孔法,、脂質(zhì)體法各有利弊,其主要主要原理及應(yīng)用特點如下：

 除上述傳統(tǒng)方法外，近年來國際上推出了一些陽離子聚合物基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，以其適用宿主范圍廣、操作簡便、對細(xì)胞毒性小、轉(zhuǎn)染效率高受到研究者們的青睞.其中樹枝狀聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亞胺（Polyethylenimine,PEI）的轉(zhuǎn)染性能最佳，但樹枝狀聚合物的結(jié)構(gòu)不易于進(jìn)一步改性，且其合成工藝復(fù)雜。聚乙烯亞胺是一種具有較高的陽離子電荷密度的有機大分子，每相隔二個碳個原子，即每“第三個原子都是質(zhì)子化的氨基氮原子，使得聚合物網(wǎng)絡(luò)在任何pH下都能充當(dāng)有效的“質(zhì)子海綿”(proton sponge)體。這種聚陽離子能將各種報告基因轉(zhuǎn)入各種種屬細(xì)胞，其效果好于脂質(zhì)聚酰胺，經(jīng)進(jìn)一步的改性后，其轉(zhuǎn)染性能好于樹枝狀聚合物，而且它的細(xì)胞毒性低。大量實驗證明，PEI是非常有希望的基因治療載體。目前在設(shè)計更復(fù)雜的基因載體時，PEI經(jīng)常做為核心組成成分。
  線型PEI（Line PEI，LPEI）與其衍生物用作基因轉(zhuǎn)染載體的研究比分枝狀PEI（Branched PEI，BPEI）要早一些，過去的研究認(rèn)為在不考慮具體條件，LPEI/DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物的細(xì)胞毒性較低，有利于細(xì)胞定位，因此與BPEI相比應(yīng)該轉(zhuǎn)染效率高一些。但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，從而提高轉(zhuǎn)染效率，但同時細(xì)胞毒性也增大。超高分枝的、較柔性的PEI衍生物含有額外的仲胺基和叔胺基，在染實驗中發(fā)現(xiàn)這種PEI的毒性低，但轉(zhuǎn)染效率卻較高.。

GenEscort是采用各種分枝狀和超高分枝狀的小分子PEI與各種含有生理條件下可降解鍵的交聯(lián)劑交聯(lián)，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝結(jié)構(gòu)使得其具有較高的正電性，因此易于高效地包裹各種DNA、RNA分子及質(zhì)粒形成小的納米顆粒 ,從而提高轉(zhuǎn)染效率，當(dāng)所形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞以后，其中所含的生理條件下可降解的化學(xué)鍵在細(xì)胞內(nèi)水解，使交聯(lián)聚合物分解為無細(xì)胞毒性的小分子PEI，這樣結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)染試劑在體外應(yīng)用可以獲得高的轉(zhuǎn)染效率和低的細(xì)胞毒性，其可降解性對體內(nèi)應(yīng)用也具有重要的意義。

實驗材料：

15ml離心管、培養(yǎng)皿、滴管 、酒精燈、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)液、胎牛血清、轉(zhuǎn)染試劑、質(zhì)粒、PBS、75%酒精、0.25%胰酶、超凈工作臺、二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、顯微鏡、離心機、恒溫水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、廢液缸等。

實驗步驟（以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染為例）：

脂質(zhì)體(LR)試劑是陽離子脂質(zhì)體DOTMA和DOPE的混合物(1：1)。它適用于把 DNA 轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中，是目前條件下最方面的轉(zhuǎn)染方法之一。轉(zhuǎn)染率高，優(yōu)于磷酸鈣法，比它高5-100倍，能把DNA和RNA轉(zhuǎn)染到各種細(xì)胞。
用LR進(jìn)行轉(zhuǎn)染時，首先需要優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，應(yīng)找出該批LR對轉(zhuǎn)染某一特定細(xì)胞適合的用量、作用時間等，對每批LR都要做。先要固定一個DNA的量和DNA/LR混合物與細(xì)胞相互作用的時間，DNA可從1-5ug和孵育時間6h，開始，按這兩個參數(shù)繪出相應(yīng)LR需用量的曲線，再選用LR和DNA兩者最佳的劑量，確定出轉(zhuǎn)染時間。因LR對細(xì)胞有一定的毒性，轉(zhuǎn)染時間以不超過24h為宜。

一、方法一的操作步驟
1、取6孔培養(yǎng)板，向每孔中加入2ml含(1-2) x 10 5 個細(xì)胞的培養(yǎng)基，37℃、18% CO 2 培養(yǎng)基40%-60%匯合時。

2、轉(zhuǎn)染液制備：在聚苯乙烯管中制備以下兩液(為轉(zhuǎn)染1個空細(xì)胞所用的量)。
A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋DNA使?jié)舛葹?-10ug，終量100ul。
B液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋LR，使終濃度為2-50ug，終量100ul。
輕輕混合A液、B液，室溫中置10-15min，稍后會出現(xiàn)微濁現(xiàn)象，但并不妨礙轉(zhuǎn)染。
3、轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備：用2ml不含血清培養(yǎng)基漂洗2次，再加入1ml不含血清培養(yǎng)基。
4、轉(zhuǎn)染：把A/B復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)基中，搖勻，置37℃溫箱中6-24h，吸除無血清轉(zhuǎn)染液，換入正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
5、其余處理：如觀察、篩選、檢測等與其他轉(zhuǎn)染法相同。
6、注意：轉(zhuǎn)染時切勿加血清，血清對轉(zhuǎn)染效率有很大影響。

二、快速脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作步驟(方法二)：
1、 將細(xì)胞以5 x 105個/孔接種于6孔板中培養(yǎng)24h，使其達(dá)到50%-60%板底面積。
2、 在試管中配制DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。
a. 在1ml無血清DMEM中稀釋PSV1-neo質(zhì)粒DNA或供體DNA。
b. 旋轉(zhuǎn)1s，再加入脂質(zhì)體懸液，旋轉(zhuǎn)。
c. 室溫下放置5-10min，使DNA結(jié)合在脂質(zhì)體上。
3、 棄去細(xì)胞中的舊液，用1ml無血清DMEM洗細(xì)胞1次后棄去，向每孔中直接加入1mlDNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，37℃培養(yǎng)3-5天。
4、再于每孔中加入含20%胎牛血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)14-24h。
5、吸出DMEM-DNA-脂質(zhì)體混合物加入新鮮含10%胎牛血清的DMEM，2ml/孔，再培養(yǎng)24-48h。
6、用細(xì)胞刮或消化法收集細(xì)胞，以備分析鑒定。

三、穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法：
1、接種細(xì)胞同前述，細(xì)胞長至50%板底面積可用于轉(zhuǎn)染。
2、DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物制備轉(zhuǎn)染細(xì)胞同前。
3、在每孔中加入1ml含20%胎牛血清的DMEM，37℃培養(yǎng)48h。
4、吸出DMEM，用G418選擇性培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞，使細(xì)胞生長一定時間，篩選轉(zhuǎn)染克隆，方法參照細(xì)胞克隆篩選法進(jìn)行。

四、Invitrogen公司的Lipofectamine2000在24孔板轉(zhuǎn)染單層貼壁細(xì)胞。(別的方法可以參考生產(chǎn)商提供的protocol)
1、轉(zhuǎn)染前1天將0.5～2×105細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，并加入500ul不含 抗生素 的完全培養(yǎng)基，以保證轉(zhuǎn)染時細(xì)胞匯合達(dá)90～95％。
2、準(zhǔn)備復(fù)合物
a. 將0.8ug DNA稀釋于50ul無血清無抗生素的培養(yǎng)液中輕輕渾勻。
b. 將2ul Lipofectamine2000稀釋于50ul無血清無抗生素的培養(yǎng)液中，輕輕渾勻，室溫孵育5分。注意：必須在25分內(nèi)進(jìn)行。
c. 5分后將它們混合，并輕輕渾勻，室溫孵育20分。
3、吸去培養(yǎng)板的培養(yǎng)基，用PBS或無血清培養(yǎng)基(最好)清洗細(xì)胞2次。
4、將復(fù)合物(總體積100ul)加入培養(yǎng)孔，前后搖動培養(yǎng)板使其分布均勻。
5、將細(xì)胞放入 培養(yǎng)箱 孵育4～6h后，可以更換含血清培養(yǎng)液去除復(fù)合物(也可不用)。
6、24～48h后可以觀察轉(zhuǎn)入 基因表達(dá) 情況。
7、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：換含血清培養(yǎng)基24h后將細(xì)胞以1：10(或更高比例)傳代，1天后更換篩選培養(yǎng)基篩選。
8、優(yōu)化：要保證細(xì)胞匯合率達(dá)90～95％(比較高)；DNA/ Lipofectamine2000比率1：0.5～1：5，一般細(xì)胞1：2～3。

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