實(shí)驗(yàn)原理

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)首先在1967年由Shapir0建立，其原理：聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺(簡(jiǎn)稱Acr)和交聯(lián)劑N，N’一亞甲基雙丙烯酰胺(簡(jiǎn)稱Bis)在催化劑過硫酸銨(APS)，N，N，N’，N’四甲基乙二胺(TEMED)作用下，聚合交聯(lián)形成的具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的凝膠，并以此為支持物進(jìn)行電泳。

丙烯酰胺凝膠電泳可根據(jù)不同蛋白質(zhì)分子所帶電荷的差異及分子大小的不同所產(chǎn)生的不同遷移率將蛋白質(zhì)分離成若干條區(qū)帶，如果分離純化的樣品中只含有同一種蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)樣品電泳后，就應(yīng)只分離出一條區(qū)帶。SDS是一種陰離子表面活性劑能打斷蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵，并按一定的比例和蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其本身原有的電荷，掩蓋了各種蛋白分子間天然的電荷差異。因此，各種蛋白質(zhì) SDS復(fù)合物在電泳時(shí)的遷移率，不再受原有電荷和分子形狀的影響，只是分子量的函數(shù)。這種電泳方法稱為SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(簡(jiǎn)稱SDS-PAGE)。由于SDS-PAGE可設(shè)法將電泳時(shí)蛋白質(zhì)電荷差異這一因素除去或減小到可以忽略不計(jì)的程度，因此常用來鑒定蛋白質(zhì)分離樣品的純化程度，如果被鑒定的蛋白質(zhì)樣品很純，只含有一種具三級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)或含有相同分子量亞基的具四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，那么 SDS-PAGE后，就只出現(xiàn)一條蛋白質(zhì)區(qū)帶。SDS-PAGE可分為圓盤狀和垂直板狀、連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)采用垂直板狀不連續(xù)系統(tǒng)。所謂“不連續(xù)”是指電泳體系由兩種或兩種以上的緩沖液、pH和凝膠孔徑等所組成。

實(shí)驗(yàn)材料

(一)試劑

1、30%丙烯酰胺混合液(Acr:Bis 為 29:1) 稱取丙烯酰胺(Acr ) 29g 及甲叉丙烯酰胺(Bis ) 1.0g ,用 去離子水溶解并稀釋至 100ml ,貯棕色瓶中于 4℃保存,可用一個(gè)月。

2、1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl緩沖液 取 1mol/L HCL溶液 48ml 、三羥甲基甲烷(Tris ) 36.6g ,加雙蒸餾水 至 80ml 使其溶解,調(diào) pH 至 8.8,然后用雙蒸餾水稀釋至 100ml ,置棕色瓶中, 4℃貯存。

3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl緩沖液 取 1mol/L HCL溶液 48ml , Tris5.98g , 加雙蒸餾水至 80ml , 調(diào) pH6.8, 用雙蒸餾水稀釋至 100ml ,置棕色瓶中, 4℃貯存。

4、Tris-甘氨酸電泳緩沖液 稱取 Tris 6g、 甘氨酸 28.8g , 加蒸餾水 850ml , 調(diào) pH 至 8.3, 加蒸餾水到 1000ml , 4℃貯存。用時(shí)可做 10倍稀釋。

5、10% 過硫酸銨(AP )(6)四甲基乙二胺(TEMED )或 β-二甲基氨基丙腈(DMAPN )。

6、10%SDS(十二烷基磺酸鈉) 稱取 SDS 10g,加蒸餾水 100ml 使其溶解。

7、四甲基乙二胺(TEMED )

8、上樣緩沖液 取 1.0mol/LpH6.8Tris-HCl緩沖液 6.25ml ,蔗糖 10g , SDS 2.3g, 1g/L溴酚藍(lán) 10ml ,加 蒸餾水溶解,混合至 100ml。

9、考馬斯亮藍(lán)染色試劑 考馬斯亮藍(lán) R250染色液:濃度為 2.5g/L,用甲醇∶醋酸∶蒸餾水 =5∶ 1∶ 5的溶 液配制(V/V)。

10、脫色液:取冰醋酸 7.5ml 、甲醇 5ml ,加蒸餾水至 100ml。

11、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)志物 市售中分子量蛋白質(zhì)分子量標(biāo)志物。也可選擇 5種以上的已知分子量蛋白質(zhì)自 行配制,注意其分子量分布要能滿足需要,各種蛋白質(zhì)的濃度基本相等。

 

(二)儀器

圓盤電泳槽(或垂直板電泳槽)、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 、脫色搖床。

SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳步驟

將收集的各樣品加入等體積的2×SDS-PAGE Loading Buffer，煮沸裂解5min，冰浴2min，12,000rpm離心10min，取上清-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1）按照電泳裝置的使用說明，裝好潔凈干燥的玻璃板。

2）分離膠的制備

按下列成分配制10mL 12%分離膠：

ddH2O 30%丙烯酰胺混合液 1.5MTris(pH8.8) 10%SDS 10%過硫酸銨 TEMED 總體積

3.3 mL 4.0 mL 2.5ml 0.1ml 0.1ml 0.004ml 10 mL

各成分加入后迅速旋渦混勻，用微量移液器將其小心地注入準(zhǔn)備好的玻璃板間隙中，并為積層膠留出足夠空間。輕輕在頂層加入一薄層水封頂，以防止空氣中的氧對(duì)凝膠聚合的抑制作用。凝膠聚合完成后，倒掉覆蓋的水層，用水清洗凝膠頂部數(shù)次，用濾紙吸干凝膠頂端的水。

3）積層膠的制備

按下列成分配制2mL 5%的積層膠：

ddH2O 30%丙烯酰胺混合液 1.0M Tris(pH6.8) 10%SDS 10%過硫酸銨 TEMED 總體積

1.4mL 0.33ml 0.25mL 0.02mL 0.02mL 0.002mL 2mL

各成分加入后迅速旋渦混勻，用微量移液器將其灌注到分離膠上，灌滿后小心插入加樣梳，盡可能避免產(chǎn)生氣泡。

4）待積層膠凝固后，小心拔下梳子。

5）將凝膠固定于電泳裝置上，加入足量的1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液，在加樣孔中分別加入20μL各樣品。

6）樣品在積層膠中電泳時(shí)，使用80V電壓，待溴酚藍(lán)帶進(jìn)入分離膠后，將電壓升至120V，繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)帶到達(dá)分離膠的底部且開始泳出膠底面，關(guān)閉電源。

7）卸下凝膠，將其浸泡在至少5倍體積的考馬斯亮藍(lán)R-250染色液中，置水平搖床上室溫染色至少4h，之后取出染色的凝膠并回收染液，以備再用，將凝膠浸泡于考馬斯亮藍(lán)脫色液中，在水平搖床上脫色4-8h，其間更換脫色液3-4次，直至凝膠脫色到條帶清晰為止，觀察記錄結(jié)果并拍照。

 

注意事項(xiàng)

1、做膠：防止漏膠、進(jìn)氣泡以及花膠（水封、插梳子和拔梳子）。

2、加樣：兩邊加loading，加樣量一樣，加樣時(shí)間要盡量短，以免樣品擴(kuò)散。

3、電泳：將膠夾好放于電泳槽中，加電泳buffer（內(nèi)外面不能聯(lián)通），將電壓調(diào)到90V開始電泳。

4、本法也適合于其他生物樣品中蛋白質(zhì)的分析。上樣量不宜過大,否則會(huì)出現(xiàn)過載現(xiàn)象。尤其是考馬斯亮 藍(lán) R250染色, 在蛋白質(zhì)濃度過高時(shí), 染料與蛋白質(zhì)的氨基 (-NH) 形成的靜電鍵不穩(wěn)定, 其結(jié)合不符合 Beer 定律,使蛋白質(zhì)量不準(zhǔn)確。

5、Acr 和 Bis 有神經(jīng)毒性,可經(jīng)皮膚、呼吸道等吸收,故操作時(shí)要注意保護(hù)。

 

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