實驗原理

從細胞或組織中得到RNA是一種混合物，其中包括tRNA，rRNA和mRNA，其中RNA為75％～ 85％，tRNA占10％～16％，而mRNA僅占1%～5％，并且mRNA基因序列不同，分子量大小不均一，各基因的表達豐度也不一樣。每克細胞可分離出5-10mg RNA。

真核生物mRNA具有5’端帽子結(jié)構(gòu)（m7G）和3’端的poly(A)尾巴。絕大多數(shù)哺乳動物細胞的3’端存在20-300個腺苷酸組成的poly（A）尾，這種結(jié)構(gòu)為真核mRNA分子的分離和純化，提供了極為方便的條件，寡聚（dT）纖維素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的實驗理論就在于此。

一般mRNA分離純化的原理就是根據(jù)mRNA 3’端含有poly(A)尾巴結(jié)構(gòu)特性設(shè)計的。當(dāng)總RNA流經(jīng)寡聚（dT）（即oligo(dT)）纖維素柱時，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異地吸附在oligo(dT)纖維素柱上，在低鹽濃度或蒸餾水中，mRNA可被洗下，經(jīng)過oligo(dT)纖維素柱吸附和解吸附，即可得到較純的mRNA。

實驗材料

1、0.1mol/L NaOH （用0.1% DEPC處理過的無RNase水配置）

2、寡聚Oligo（dT）-纖維素

3、加樣/洗滌緩沖液1：0.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每組250mL或0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(pH8.0), 0.1% SDS。（用0.1% DEPC處理過的無RNase水配置）

4、洗滌緩沖液2：0.1 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每組250mL或10mmol/L Tris-HCl (pH7.6), 1mmol/L EDTA (pH8.0), 0.05% SDS。（用0.1% DEPC處理過的無RNase水配置）

5、5 mol/L NaCl（加0.1% DEPC處理過夜）

6、3 mol/L NaAc pH5.2（加0.1% DEPC處理過夜）

7、無RNase雙蒸水(DEPC水)

8、70%乙醇（用0.1% DEPC處理過的無RNase水配置）

需要用到的實驗儀器：恒溫水浴箱，高速冷凍離心機，紫外分光光度計，巴斯德吸管，玻璃棉，5ml一次性注射器。

實驗過程

（一） oligo(dT)纖維素的預(yù)處理

1、用0.1mol/L NaOH懸浮0.5-1.0g oligo(dT)纖維素。

2、將懸浮液裝入填有經(jīng)DEPC水處理，高壓滅菌后的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床約0.5-1.0mL，用3倍柱床體積的無RNase的滅菌雙蒸水沖洗oligo(dT)纖維素。

3、用3-5倍柱床洗滌緩沖液I沖洗oligo(dT)纖維素，直到流出液的pH值小于8.0。

4、將處理好的oligo(dT)纖維素從巴斯德吸管倒出，用適當(dāng)?shù)闹�床洗滌緩沖液I懸浮，濃度約為0.1g/mL，保存在4℃待用。

 

（二） 總RNA濃度的調(diào)整

1、把總RNA液轉(zhuǎn)到適合的無RNase離心管中，測定總RNA的濃度。如果總RNA的濃度大于0.55mg/mL，則用無RNase的雙蒸水稀釋至0.55mg/mL，總RNA的濃度對除去rRNA是很重要的。濃度調(diào)整以后，把RNA溶液置于65℃水浴加熱5 min，然后迅速插在冰上冷卻。

2、加入一定體積5 mol/L NaCl使RNA溶液中鹽的濃度調(diào)至0.5 mol/L。

（三） mRNA的分離

1、mRNA與Oligo(dT)-纖維素結(jié)合：用移液器重新懸浮oligo(dT)-纖維素，取適量的oligo(dT)-纖維素到RNA樣品中，蓋上蓋子，顛倒數(shù)次將oligo(dT)-纖維素與RNA混勻。于37℃水浴保溫并溫和搖蕩15min。oligo(dT)-纖維素與RNA所需量如下表。

 

表1 總RNA量所需材料的體積

總RNA（mg）	oligo(dT)-纖維素（ml）	洗滌緩沖液1,2（ml）	洗脫體積（ml）
<0.2	0.2	1.0	1.0
0.2-0.5	0.5	1.5	1.5
0.5-1.0	1.0	3.0	3.0
1.0-2.0	2.0	5.0	5.0

 

2、轉(zhuǎn)移：取1個5ml注射器，用經(jīng)過高溫滅菌的玻璃棉塞緊注射器前端，注射器固定在無RNase的支架上，把oligo(dT)-纖維素/RNA懸浮液加入注射器中，把塞子推到底部，收集流出的液體，即把含有未結(jié)合上的RNA液體收集到無RNase的離心管中（保留至確定獲得足夠的mRNA）。

3、洗滌：根據(jù)表1所需洗滌緩沖液1的體積，直接用注射器慢慢吸取，溫和振蕩，充分懸浮mRNA-oligo(dT)-纖維素，推動塞子，用無RNase的離心管收集洗出液。測定每一管的OD260，當(dāng)洗出液中OD值為0時準(zhǔn)備洗脫。

4、洗脫：根據(jù)表1所需洗脫液體積，用注射器慢慢吸取洗脫緩沖液2或無RNase雙蒸水到注射器內(nèi)，充分重懸mRNA-oligo(dT)-纖維素，推動塞子，以1/3至1/2柱床體積分裝到無RNase的離心管中。

5、測定每一管的OD260，合并含有RNA的洗脫液。在4℃條件下，2500g，離心2-3min，將上清轉(zhuǎn)移至新無RNase的離心管中。

6、沉淀：向上清液中加入1/10體積的3mol/L NaAc （pH5.2）, 再加入2.5倍體積的冰冷乙醇，混勻后，-20℃條件下沉淀30min或放置過夜。

7、離心收集：4℃條件下，12000g, 離心15min，小心棄去上清，用70%乙醇漂洗沉淀，4℃條件下，12000g, 離心5 min，小心棄去上清液。沉淀空氣干燥10min。將mRNA沉淀溶于適當(dāng)體積的無RNase的雙蒸水，立即用于后續(xù)實驗，或用70%乙醇溶解，貯存于-70℃。

8、定量：測定OD260和OD280，計算產(chǎn)率以及OD260/OD280的比率

 

注意事項

1、整個操作過程必須嚴格遵守?zé)oRNase操作環(huán)境，且注意操作中的低溫要求。

2、用于純化的總RNA樣品須盡量保持RNA完整，不能被降解，獲得完整mRNA質(zhì)量的前提條件。

3、總RNA與Oligo(dT)-纖維素的比例要適當(dāng)，若總RNA會影響mRNA純度。

4、RNA溶液與Oligo(dT)-纖維素結(jié)合前必須置于65℃加熱5min，其作用：（1）破壞mRNA的二級結(jié)構(gòu)，特別是poly(A+)尾處的二級結(jié)構(gòu)，使poly(A+)尾充分暴露，提高poly(A+)RNA回收率；（2）解離mRNA與rRNA的結(jié)合。加熱后應(yīng)立即插入冰上，以免由于溫度的緩慢下降使mRNA又恢復(fù)其二級結(jié)構(gòu)。

5、應(yīng)注意mRNA不能被DNA污染，否則嚴重影響實驗結(jié)果。

6、mRNA制備后，可用變性瓊脂糖凝膠電泳撿測其完整性和有無DNA污染。提取的mRNA應(yīng)該在0.5~8.0kb之間呈現(xiàn)彌散狀，無明顯區(qū)帶，但大部分的mRNA應(yīng)在1-2.0kb范圍內(nèi)呈彌散狀。經(jīng)過一次純化分離的mRNA還會有微量的rRNA殘留，但一般來說不會對后續(xù)實驗造成很大的影響，如果樣品純化后量足夠，可將經(jīng)過一次純化分離的mRNA再純化一次，進一步提高其純度。

7、為防止mRNA降解，應(yīng)避免多次凍融，可將mRNA少量分裝后保存。 也可將mRNA用70%乙醇溶解，在-70℃保存，保存時間在一年以上。

8、Oligo(dT)-纖維素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗凈，然后用層析柱加樣緩沖液平衡，并加入0.02%疊氮鈉（NaN3)，放在4℃冰箱保存。經(jīng)過預(yù)處理后可以重復(fù)使用。

 

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