中樞神經(jīng)系統(tǒng)是由許多不同類(lèi)型的細(xì)胞構(gòu)成的，包括神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。其中，根據(jù)不同的形態(tài)、大小和功能，神經(jīng)元可以分為很多類(lèi)型。而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞主要包括星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。

 AAV在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）中的應(yīng)用包括很多方面，比如在神經(jīng)系統(tǒng)疾病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中的研究和治療，以及某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型的局部轉(zhuǎn)基因研究等。

 由于AAV的血清型、轉(zhuǎn)錄因子和注射位點(diǎn)的不同，AAV在大腦中介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因通常不是均一的，這種不均一表現(xiàn)在時(shí)間和空間（不同細(xì)胞種類(lèi)的特異性）方面。除此之外，AAV病毒制備的技術(shù)（影響純度和滴度）、病毒注射的方法也會(huì)大大影響到AAV介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因的效率。值得注意的是，AAV感染后所使用的檢測(cè)方法和目的蛋白的自然屬性（胞內(nèi)蛋白/分泌蛋白/轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）等因素也會(huì)影響到最終對(duì)轉(zhuǎn)基因效果的評(píng)價(jià)。組織學(xué)染色，比如免疫組化或單/雙免疫熒光可以幫助觀察轉(zhuǎn)基因表達(dá)的分布特征，但卻不能量化評(píng)價(jià)病毒感染的效率。對(duì)腦提取物進(jìn)行ELISA或RT-qPCR可以定量轉(zhuǎn)基因效率。

事實(shí)上，通過(guò)將AAV直接注射大腦或大腦外圍區(qū)域（肌肉或靜脈注射）能夠產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)導(dǎo)模式。已經(jīng)有文獻(xiàn)證明AAV9可在小鼠/貓和非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中穿過(guò)血腦屏障。并且，AAV載體可以從肌肉逆行運(yùn)輸?shù)郊顾柽\(yùn)動(dòng)神經(jīng)元（27-30）。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，就是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的軸突接觸到AAV病毒，并將其傳遞給胞體。實(shí)驗(yàn)表明，AAV1的逆行效率較高。本文主要介紹幾種在神經(jīng)科學(xué)研究中常用的AAV注射方法。

     

 

一．通過(guò)立體定位儀直接向腦內(nèi)注射AAV（需佩戴手套和口罩）

  目前，成年雌雄大鼠和小鼠的大腦圖譜都可通過(guò)文獻(xiàn)和書(shū)籍獲得。立體定位手術(shù)時(shí)，顱骨上最常用的注射參照點(diǎn)就是前囪，也就是中矢狀冠狀縫的交叉點(diǎn)。具體的注射部位，可依據(jù)研究的需要而確定。微創(chuàng)技術(shù)可以避免炎癥，以降低轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的排斥反應(yīng)。

  1.安裝定位儀: 在生物安全柜中安裝立體定位框架和工具。

  2.準(zhǔn)備并吸滿(mǎn)病毒懸液：在噴嘴出安裝超微量注射器，把針尖浸在準(zhǔn)備好的AAV病毒懸液中，并使用“快速反向”功能吸滿(mǎn)。

  3.排除空氣：使用“快速正向”功能檢查泡沫，知道在針頭處出現(xiàn)一滴液體。用浸泡在0，1M NaOH溶液中的棉花輕輕拭去針尖的液滴。

  4.麻醉大鼠：選取250g左右的大鼠，通過(guò)25 G 1毫升注射器注射甲苯噻嗪（10mg/kg）和氯胺酮（100mg/kg）。

  5.固定大鼠：首先將大鼠的下切牙固定在齒棒上，然后用耳棒通過(guò)大鼠的外耳道進(jìn)行固定，并固定頭部。檢查顱骨是否是水平的，并確保兩個(gè)眼睛在同一水平線(xiàn)上。在每只眼睛中滴入一滴聚丙烯酸，以防麻醉造成眼睛干燥。調(diào)整光源對(duì)準(zhǔn)大鼠的頭部，剃去頭部的毛并用酒精消毒清潔。

  6.切口并暴露前囪點(diǎn)：用刀片在頭皮上前后軸切口，并用鉗子保持刀口開(kāi)放狀態(tài)，用棉球吸去血。去除骨膜以便看到前囪。

  7.暴露λ點(diǎn)：調(diào)整齒夾的垂直位置，使得前囪點(diǎn)和λ點(diǎn)的高度一致，如果λ點(diǎn)的位置難以看到，讓切口處干燥5-10min后再尋找。

  8.確定前囪點(diǎn)的AP和ML坐標(biāo)和目標(biāo)注射點(diǎn)的距離：將針垂直于前囪點(diǎn)，并記錄AP和ML坐標(biāo)的數(shù)值。參考大鼠腦圖譜的標(biāo)記的目標(biāo)注射部位的AP和ML值，計(jì)算前囪點(diǎn)與目標(biāo)注射部位的AP和ML坐標(biāo)，并做標(biāo)記。

  9.確定前囪點(diǎn)的DV坐標(biāo)和目標(biāo)注射點(diǎn)的距離：用鉆頭在顱骨上打洞，注意不要損傷硬腦膜。把針尖置于硬腦膜的表面并測(cè)量出前囪點(diǎn)DV的坐標(biāo)。計(jì)算目標(biāo)注射部位的DV坐標(biāo)。

  10.注射AAV：緩慢垂直移動(dòng)注射器針尖到達(dá)目標(biāo)注射部位，慢慢地將針插入并靜置5min。然后，以0.2 μ l/min的速度，將2μL的病毒懸液注射入腦。結(jié)束后，需要靜置5min再將注射器緩慢移出。

  11.縫合并做標(biāo)記：縫合頭皮，并做耳標(biāo)。

  12.大鼠術(shù)后的護(hù)理：將大鼠單獨(dú)放在一個(gè)干凈的籠子里，直到醒來(lái)。第一天需要讓大鼠在獨(dú)立的通風(fēng)籠中度過(guò)。

  13.處理針頭和手術(shù)材料：先用0.1 M NaOH or 10%氯漂白劑清洗手術(shù)工具，并用蒸餾水沖洗，最后用酒精沖洗。

                                

 

 

 圖1：腦立體定位儀。（1）耳棒；（2）齒棒；（3）注射器支架；（4）設(shè)置垂直坐標(biāo)的螺釘；（5）設(shè)置橫向

坐標(biāo)的螺釘；（6）設(shè)置前后坐標(biāo)的螺釘；（7）垂直游標(biāo)刻度；（8）側(cè)游標(biāo)刻度；（9）前后游標(biāo)刻度。

二．靜脈注射AAV9

（一）新生小鼠的顳靜脈注射

  1. 調(diào)整光源位置以便照亮顯微鏡區(qū)域，中等強(qiáng)度的光照最佳。

  2. 將一個(gè)新生幼鼠直接置于冰上1-3min，進(jìn)行麻醉。

  3. 當(dāng)動(dòng)物在冰上麻醉時(shí)，在注射器中注滿(mǎn)AAV病毒。體積不應(yīng)超過(guò)100μL，體積在30到100μL之間不會(huì)影響轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。

  4. 在顯微鏡下觀察幼鼠。用不持注射器的手的食指放在幼鼠口鼻處，中指放在耳芽處，以便拉伸幼鼠的皮膚，可見(jiàn)顳淺靜脈。

  5. 確定顳淺靜脈。可通過(guò)皮膚看到位于耳芽前部，周?chē)�毛�?xì)血管下部，有一條隱約可見(jiàn)的靜脈血管，從背部到腹部，匯入頸靜脈，這就是顳淺靜脈。

  6. 注射器針尖斜面插入顳靜脈�？梢钥吹结樇庑泵嫱ㄟ^(guò)皮膚的以后被血填充。輕壓注射器，并注意幼鼠臉側(cè)面的靜脈變白。

（二）成年小鼠的尾靜脈注射

  1. 確保動(dòng)物進(jìn)入約束裝置。

  2. 用酒精擦拭尾巴。

  3. 把尾巴置于溫水中。

  4. 將注射器吸滿(mǎn)AAV病毒懸液。

  5. 將注射器插入尾靜脈中。如果沒(méi)有瞄準(zhǔn)，可以靠近尾巴根部再試一次。

  6. 注射病毒溶液。體積控制在100-250μL。

  7. 將小鼠放回籠內(nèi)。

                                 

 

                                              圖2：動(dòng)物約束裝置

 

三．AAV從周?chē)�神�?jīng)到目標(biāo)神經(jīng)元的逆行運(yùn)輸

  1.選取250g左右的大鼠，通過(guò)25 G 1毫升注射器注射甲苯噻嗪（10mg/kg）和氯胺酮（100mg/kg）。

  2.將麻醉后的大鼠置于無(wú)菌布上。在每只眼睛中滴入一滴聚丙烯酸，以防麻醉造成眼睛干燥。

  3.刮去肌肉附近的毛發(fā)并用酒精清潔。用刀片在皮膚上切一個(gè)小口，并用鉗保持刀口開(kāi)放，以暴露肌肉。

  4.使用超微量注射器吸入AAV病毒懸液，并排除空氣和氣泡。

  5.擠壓肌肉以使肌肉建立起一定的厚度，并把針尖置于肌肉上。

  6.緩緩插入針尖，并在肌肉中靜置1min。然后以10μl/min的速度注入10-20μl的AAV懸液。

  7.注射結(jié)束后，將針在肌肉中靜置2min，然后緩緩拔出。可進(jìn)行多次注射。

  8.縫合皮膚并做耳標(biāo)。將大鼠單獨(dú)放在一個(gè)干凈的籠子里，直到醒來(lái)

  9.先用0.1 M NaOH or 10%氯漂白劑清洗手術(shù)工具，并用蒸餾水沖洗，最后用酒精沖洗。

 

 

                      

圖3：超微量注射器