腺相關(guān)病毒（AAV）屬于依賴病毒屬，細(xì)小病毒亞科，是一類(lèi)自然缺陷的單鏈DNA病毒。野生型AAV基因組約4.7kb，含有rep和cap基因以及兩端的ITR序列。盡管人類(lèi)對(duì)AAV易感，但臨床還并未發(fā)現(xiàn)與AAV相關(guān)的疾病。根據(jù)AAV衣殼蛋白基因的變異，可將AAV分為不同的血清型。不同血清型的AAV具有不同的組織特異性。將興趣基因取代rep和cap基因構(gòu)建一個(gè)兩段帶有ITR的載體，并將rep和cap置于一個(gè)獨(dú)立的載體上，加上帶有腺病毒輔助基因載體，便可包裝出帶有興趣基因的重組腺相關(guān)病毒（rAAV）。

目前rAAV已被廣泛作為基因轉(zhuǎn)導(dǎo)載體使用，rAAV在人體實(shí)驗(yàn)中的安全性也已被證實(shí)。早在1996年，科學(xué)家們就選擇肺作為rAAV的第一個(gè)靶向?qū)嶒?yàn)器官。下面我們旨在介紹rAAV在肺部實(shí)驗(yàn)中的啟動(dòng)子、血清型的選擇，及其小鼠肺部的AAV注射方法。

• 啟動(dòng)子的選擇

根據(jù)不同的注射方式和實(shí)驗(yàn)?zāi)康模�可選擇不同的啟動(dòng)子以提高肺部表達(dá)效率。CMV在啟動(dòng)真核基因表達(dá)方面具有極高的效率，可高效感染小鼠肺部；CAG同樣具有出色的感染氣道的能力。

• 血清型的選擇研究表明，針對(duì)肺部感染rAAV在血清

研究表明，針對(duì)肺部感染rAAV在血清型上的選擇根據(jù)動(dòng)物模型的不同而存在差異，主要體現(xiàn)在小鼠及較低等靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物與高等靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中之間。

 在小鼠及一些較低等的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中，AAV5及AAV6是感染肺部的最佳選擇。

血清型	感染表面	感染部位及水平	受體
rAAV2	基底層遠(yuǎn)大于表層	氣道細(xì)胞：低水平或無(wú) 肺泡細(xì)胞：低水平或無(wú) 支氣管上皮：低水平或無(wú) 氣道平滑�。褐械人�平	硫酸肝素（Heparin Sulfate）
rAAV5	基底層大于表面層	氣道細(xì)胞：中等水平 肺泡細(xì)胞：中等水平	PDGFR，2-5聯(lián)唾液酸受體
rAAV6	表層	氣道細(xì)胞：中等水平 肺泡細(xì)胞：高等水平 支氣管上皮：中等水平 氣道平滑�。旱偷人�平	唾液酸糖蛋白
rAAV9	基底層和表層	氣道細(xì)胞：低等水平 肺泡細(xì)胞：中等水平	半乳糖基葡聚糖

針對(duì)高等靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，AAV1對(duì)肺部的感染效率更高；而在肺癌的研究中，我們推薦AAV血清型選擇如下：

 

種類(lèi)	AAV血清型推薦
小鼠與低等靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物肺部	AAV5/AAV6
高等靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物肺部	AAV1
肺癌	AAV2（或慢病毒）

 

• 小鼠肺部AAV注射方法

AAV感染肺部有多種方法，較為常用的方法為鼻內(nèi)滴注、氣管插管、氣管內(nèi)注射等。當(dāng)對(duì)肺部感染AAV的特異性要求較低時(shí)，也可采用靜脈注射的方法；當(dāng)進(jìn)行肺癌成瘤實(shí)驗(yàn)時(shí)，也可采用瘤內(nèi)注射的方式。

 

在此，我們針對(duì)鼻內(nèi)滴注、內(nèi)鏡輔助口腔氣管插管術(shù)及氣管內(nèi)注射進(jìn)行介紹。

• 鼻內(nèi)滴注法

鼻內(nèi)滴注法是一種直接的AAV感染法，操作簡(jiǎn)單且對(duì)設(shè)備要求低，對(duì)新手實(shí)驗(yàn)員也同樣適用。缺點(diǎn)是AAV顆粒容易沉積在上呼吸道（鼻道、鼻竇和咽）和胃腸道，如果需要有效地感染到下呼吸道，則可能需要更大劑量的AAV才能實(shí)現(xiàn)。

• 腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪將小鼠麻醉；            

（動(dòng)物必須處于足夠深的麻醉狀態(tài)以防止運(yùn)動(dòng)或?qū)�載體的反應(yīng)而打噴嚏或咳嗽）

（2）將小鼠以背臥姿勢(shì)固定在嚙齒動(dòng)物工作臺(tái)上；

（3）將門(mén)牙環(huán)置于小鼠上門(mén)牙上，并將尼龍搭扣連接到嚙齒動(dòng)物工作臺(tái)下表面的相應(yīng)尼龍搭扣上；

（4）慢慢地將AAV懸液通過(guò)小鼠鼻孔內(nèi)壁逐滴滴入，為保證最大地肺部感染效率，最小體積為50μL（每個(gè)鼻孔25μL），最大體積為75μL（每個(gè)鼻孔37.5μL）。待小鼠呼吸恢復(fù)正常后，再滴入一次75μL的AAV懸液；

（5）將小鼠輕輕從工作臺(tái)拿下，并將頭部和胸部用折疊的紙巾小幅度墊高，以保證小鼠順暢的呼吸；           

（6）小鼠蘇醒后，放回鼠籠。

• 內(nèi)鏡輔助口腔氣管插管術(shù)

口腔氣管插管術(shù)能夠?qū)⒉《据d體直接灌輸入肺中，卻沒(méi)有外科手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)，并且避免了上呼吸道的病毒顆粒的損失。由于幾乎所有AAV病毒顆粒都會(huì)到達(dá)肺內(nèi)，所以要嚴(yán)格控制AAV的使用量。同時(shí)，與鼻內(nèi)滴注法相比，口腔氣管插管術(shù)需要一些特殊設(shè)備，操作起來(lái)也稍有難度。

 

• 腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪將小鼠麻醉；            

（動(dòng)物必須處于足夠深的麻醉狀態(tài)以防止運(yùn)動(dòng)或?qū)�載體的反應(yīng)而打噴嚏或咳嗽）

• 將小鼠以背臥姿勢(shì)固定在嚙齒動(dòng)物工作臺(tái)上；

• 將門(mén)牙環(huán)置于小鼠上門(mén)牙上，并將尼龍搭扣連接到             嚙齒動(dòng)物工作臺(tái)下表面的相應(yīng)尼龍搭扣上；
• 小鼠的背部應(yīng)完全平放在工作臺(tái)上，胸部不應(yīng)偏向兩側(cè)，并用尼龍扣完全固定；

• 用尖頭棉棒把小鼠的舌頭卷起；
• 輕輕地把附有耳鏡的插管鏡插入喉嚨深部的氣管開(kāi)口處（大約在耳朵前部），插管鏡的凹面應(yīng)遠(yuǎn)離舌頭；
• 輕輕移動(dòng)耳鏡直到可以看到喉部（有時(shí)需稍微旋轉(zhuǎn)鏡子，以獲得最佳視野）；操作時(shí)需注意動(dòng)作幅度要小，如果只能看到舌頭背面，則需重新移出從頭開(kāi)始操作；
• 當(dāng)可以看清喉部時(shí)，便可加入一滴2%的利多卡因，在插管前，插管鏡可移出（小于30s），在此期間要定位導(dǎo)管針；
• 30秒以后，重復(fù)步驟（3）—（5），重新插入插管鏡，重新找到可以看清喉部的位置；
• 重新可以看清喉部后，導(dǎo)管針首先進(jìn)入氣管開(kāi)口，針到位后，插管鏡可以移出，然后引導(dǎo)導(dǎo)管緩緩向下，直到導(dǎo)管的中心（粉色部分）接觸到小鼠門(mén)牙，每只小鼠不要嘗試2次以上插入導(dǎo)管；
• 一旦導(dǎo)管到位，要把針移出以便小鼠正常呼吸；
• 確定導(dǎo)管在氣管內(nèi)的正確位置；
• 用0.35mL的注射器通過(guò)導(dǎo)管按照3μL/g體重輸入AAV；
• 立刻使用1mL無(wú)針頭注射器輸入0.2mL空氣，并重復(fù)2-3次以減少AAV在導(dǎo)管內(nèi)的殘留；
• 把導(dǎo)管移出；
• 將小鼠輕輕從工作臺(tái)拿下，并將頭部和胸部用折疊的紙巾小幅度墊高，以保證小鼠順暢的呼吸；
• 對(duì)小鼠狀態(tài)進(jìn)行監(jiān)測(cè)直到其蘇醒，預(yù)計(jì)在24到36小時(shí)之內(nèi)會(huì)恢復(fù)輕到中度的呼吸。

 

• 氣管內(nèi)注射

與鼻內(nèi)滴注相比，氣管內(nèi)注射能夠提高AAV進(jìn)入肺部的效率；而與口腔氣管插管法相比，設(shè)備更簡(jiǎn)單，操作更容易。與此同時(shí)，氣管內(nèi)注射具有極高的外科手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，包括出血、切口開(kāi)裂、感染以及較長(zhǎng)的恢復(fù)期等。不僅如此，由于小鼠氣管窄小，也很容易出現(xiàn)失誤，將AAV注射到氣管周?chē)�組織或食管中去。

 

 

• 腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪將小鼠麻醉；            

（動(dòng)物必須處于足夠深的麻醉狀態(tài)以防止運(yùn)動(dòng)或?qū)�載體的反應(yīng)而打噴嚏或咳嗽）

• 將小鼠以背臥姿勢(shì)固定在嚙齒動(dòng)物工作臺(tái)上，固定好下巴和四支前端，并保證小鼠在45°斜面上，頭略微抬高；
• 去除小鼠頸腹側(cè)的毛發(fā)（從喉嚨至胸）；
• 使用濕潤(rùn)的紗布海綿清洗脫毛區(qū)域，再用含氯溶液擦拭皮膚，最后用70%酒精擦拭；
• 在小鼠頸上部切一4mm左右切口；
• 使用組織鑷輕輕穿過(guò)皮下組織，找到頸部帶狀肌覆蓋的氣管；
• 在帶狀肌上輕輕切口暴露氣管；
• 一旦可以看到氣管，將針頭斜面向上平行插入氣管，針尖指向肺部，按照3μL/g體重輸入AAV，然后將針拔出；
• 將切口縫合或使用皮膚膠水粘合；
• 將小鼠輕輕從工作臺(tái)拿下，并將頭部和胸部用折疊的紙巾小幅度墊高，以保證小鼠順暢的呼吸；
• 對(duì)小鼠狀態(tài)進(jìn)行監(jiān)測(cè)直到其蘇醒。