真菌/酵母細(xì)胞線粒體DNA萃取試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

真菌/酵母細(xì)胞線粒體DNA萃取試劑是一種旨在使用生物、化學(xué)和物理方法相結(jié)合，有效去除真菌/酵母菌細(xì)胞壁，進(jìn)一步快速且充分裂解真菌/酵母菌細(xì)胞，從而分離出完整而純化的線粒體細(xì)胞器，然后進(jìn)一步生物酶處理以獲得高質(zhì)量的線粒體DNA的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適合于各種新鮮培養(yǎng)或凍存的野生型或突變型真菌/酵母菌菌株細(xì)胞的線粒體核酸成分的分離。用于后續(xù)的雜交、克隆、酶切、PCR分析等。產(chǎn)品即到即用，操作簡(jiǎn)易，性能穩(wěn)定，無核酶污染，萃取純度和產(chǎn)量皆高。

技術(shù)背景

線粒體細(xì)胞器的研究是現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)的最重要的課題之一。線粒體成為生物衰老、古生物、細(xì)胞凋亡等研究的主要對(duì)象。線粒體DNA的分離和定量以及突變分析是研究中必不可少的。 

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）        500毫升

平衡液（Reagent B）   500毫升

酶解液I（Reagent C）          1毫升

裂解液（Reagent D）         80毫升

凈化液（Reagent E）    20毫升

強(qiáng)化液（Reagent F）    10毫升

保存液（Reagent G）   200毫升

破膜液（Reagent H）          6毫升

去干擾液（Reagent I）   600微升

酶解液II（Reagent J）   600微升

萃取液（Reagent K）     6毫升

濃縮液（Reagent L）     2毫升

助沉液（Reagent M）    20微升

沉淀液（Reagent N）    20毫升

純化液（Reagent O）    20毫升

緩沖液（Reagent P）     1毫升

產(chǎn)品說明書     1份

保存方式

保存酶解液I（Reagent C）和凈化液（Reagent E）、去干擾液（Reagent I）、酶解液II（Reagent J）、萃取液（Reagent K）和助沉液（Reagent M）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，嚴(yán)格避免污染，有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于線粒體初步制備物的存放

50毫升錐形離心管：用于細(xì)胞收集后離心或清洗

1.5毫升離心管：用于保存線粒體

4℃臺(tái)式離心機(jī)：用于沉淀細(xì)胞

4℃臺(tái)式高速離心機(jī)：用于分離細(xì)胞器成分

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于沉淀核酸

渦旋震蕩儀：用于混勻

恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)物

DOUNCE勻漿器：用于裂解細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent E）凍融，然后移出1毫升凈化液（Reagent E）到4毫升的裂解液（Reagent D）里，混勻后，置入冰槽里，標(biāo)記為裂解工作液。然后進(jìn)行下列操作。

• 準(zhǔn)備好50毫升新鮮真菌/酵母菌樣品
• 在分光光度儀上測(cè)OD600＝1.0（1 OD＝1 X 10⁷細(xì)胞/毫升；總量為5 X 10⁸細(xì)胞） 
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的50毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• 加入25毫升清理液（Reagent A），混勻
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升平衡液（Reagent B），混勻
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• 加入2毫升平衡液（Reagent B），混勻
• 加入50微升酶解液I（Reagent C），混勻
• 放進(jìn)30℃恒溫水槽孵育60分鐘，期間每隔15分鐘輕輕用手搖勻
• 加入5毫升平衡液（Reagent B），混勻
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升平衡液（Reagent B），混勻
• 放進(jìn)30℃恒溫水槽孵育30分鐘，繼續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟21
• 同時(shí)將平衡液（Reagent B）置入冰槽里預(yù)冷30分鐘（注意：以下步驟在4℃環(huán)境下進(jìn)行）
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升預(yù)冷的平衡液（Reagent B），混勻
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升含有裂解液（Reagent D）和凈化液（Reagent E）的裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻細(xì)胞顆粒群
• 選擇下列其中一種方法：

方法一：物理處理法

• 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化細(xì)胞（約80下）（注意：參見注意事項(xiàng)10）
• 將所有細(xì)胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式高速離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆�！�—此步驟獲得線粒體沉淀物（注意：如果暫時(shí)停止操作，須暫時(shí)放進(jìn)－70℃冰箱里）
• 加入300微升破膜液（Reagent H）到線粒體顆粒樣品中
• 渦旋震蕩15秒，混勻顆粒群
• 轉(zhuǎn)入1.5毫升離心管
• 置入冰槽中孵育15分鐘 
• 加入30微升去干擾液（Reagent I）
• 用200微升槍頭上下抽吸混勻
• 放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育15分鐘
• 加入30微升酶解液II（Reagent J）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進(jìn)58℃恒溫水槽或干式培養(yǎng)儀孵育2小時(shí)（注意：可以孵育4至16小時(shí)，增加萃取產(chǎn)量） 
• 置于室溫下冷卻15分鐘，直至處于室溫狀態(tài)（或置于冰槽里15至30秒）
• 加入300微升萃取液（Reagent K）（注意：使用前搖勻）
• 渦旋震蕩5秒
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移出上層液相溶液到新的1.5毫升離心管（注意：切莫觸碰液相交界面上的白色膜狀物）
• 加入100微升濃縮液（Reagent L）到新的離心管
• 加入1微升助沉液（Reagent M）
• 加入800微升沉淀液（Reagent N）
• 在渦旋震蕩儀上震蕩5秒，充分混勻
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：離心前做好方位標(biāo)記，以便離心后觀察管底沉淀顆粒）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升純化液（Reagent O）
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 空氣中晾干沉淀顆粒群
• 加入20微升緩沖液（Reagent O）
• 溶解后放進(jìn)－20℃冰箱長(zhǎng)期保存或移出2微升進(jìn)行PCR反應(yīng)

方法二：化學(xué)處理法

• 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
• 加入500微升預(yù)冷的強(qiáng)化液（Reagent F）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項(xiàng)11）
• 加入5毫升預(yù)冷的保存液（Reagent G），輕輕搖動(dòng)試管混勻
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式高速離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆�！�—此步驟獲得線粒體沉淀物（注意：如果暫時(shí)停止操作，須暫時(shí)放進(jìn)－70℃冰箱里）
• 加入300微升破膜液（Reagent H）到線粒體顆粒樣品中
• 渦旋震蕩15秒，混勻顆粒群
• 轉(zhuǎn)入1.5毫升離心管
• 置入冰槽中孵育15分鐘 
• 加入30微升去干擾液（Reagent I）
• 用200微升槍頭上下抽吸混勻
• 放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育15分鐘
• 加入30微升酶解液II（Reagent J）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進(jìn)58℃恒溫水槽或干式培養(yǎng)儀孵育2小時(shí)（注意：可以孵育4至16小時(shí)，增加萃取產(chǎn)量） 
• 置于室溫下冷卻15分鐘，直至處于室溫狀態(tài)（或置于冰槽里15至30秒）
• 加入300微升萃取液（Reagent K）（注意：使用前搖勻）
• 渦旋震蕩5秒
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移出上層液相溶液到新的1.5毫升離心管（注意：切莫觸碰液相交界面上的白色膜狀物）
• 加入100微升濃縮液（Reagent L）到新的離心管
• 加入1微升助沉液（Reagent M）
• 加入800微升沉淀液（Reagent N）
• 在渦旋震蕩儀上震蕩5秒，充分混勻
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：離心前做好方位標(biāo)記，以便離心后觀察管底沉淀顆粒）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升純化液（Reagent O）
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 空氣中晾干沉淀顆粒群
• 加入20微升緩沖液（Reagent P）
• 溶解后放進(jìn)－20℃冰箱長(zhǎng)期保存或移出2微升進(jìn)行PCR反應(yīng)

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次操作（50毫升菌液：1克細(xì)胞濕重或5 X 10⁸細(xì)胞）
• 其它實(shí)際操作的細(xì)胞量與試劑使用量按比例調(diào)整：例如10毫升菌液（OD600=1）：試劑用量是標(biāo)準(zhǔn)用量的五分之一
• 操作時(shí)，須戴手套
• 整個(gè)操作須無菌操作，嚴(yán)格避免污染母液
• 50毫升（OD600＝1）菌液濕重約1克
• 細(xì)胞生長(zhǎng)條件影響線粒體的質(zhì)量：建議在有氧條件下富含葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)
• 線粒體操作均須在4℃或以下狀態(tài)下進(jìn)行
• 建議使用足夠的細(xì)胞量
• 建議嚴(yán)格控制操作時(shí)間
• 通常勻化次數(shù)為80下（或細(xì)胞顆粒群消失為止）達(dá)到80％的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同菌株的細(xì)胞會(huì)存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù)
• 通常孵育5分鐘達(dá)到80％的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同菌株的細(xì)胞會(huì)存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升裂解物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加孵育時(shí)間和渦旋震蕩次數(shù)
• 對(duì)于難以裂解的細(xì)胞，采用物理勻漿法是優(yōu)先推薦的技術(shù)處理
• 試劑中的溶液使用前搖勻；酶解液II（Reagent J）需放進(jìn)37℃溫育少許；為避免反復(fù)凍融，建議適量分裝
• 可以通過增加線粒體溶解時(shí)間（30分鐘）和酶解時(shí)間（直至16小時(shí)），獲得大量的DNA產(chǎn)量
• 通常1克真菌/酵母細(xì)胞濕重或5 X 10⁸真菌/酵母細(xì)胞提取的線粒體DNA達(dá)10至20微克，但不同菌株或培養(yǎng)條件會(huì)存在差異

16． 本產(chǎn)品所獲得的線粒體DNA純度和產(chǎn)量最為理想，確保無核DNA和外源性DNA污染

• 本公司提供系列真菌/酵母細(xì)胞線粒體試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定萃取產(chǎn)量和純化程度高
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定無基因組DNA污染