真菌/酵母細胞活性內質網(wǎng)（ER）分離試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

真菌/酵母細胞活性內質網(wǎng)（ER）分離試劑是一種旨在通過機械或化學處理和差速離心方法，從真菌/酵母細胞中分離出完整的活性內質網(wǎng)細胞器組分的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。適合于各種新鮮培養(yǎng)或凍存的野生型或突變型真菌/酵母菌菌株細胞的活性內質網(wǎng)的制備。其制備物產量高，活性保證，可以被用于細胞色素P450系統(tǒng)外源化合物（xenobiotics）代謝、脂類代謝、內質網(wǎng)膜蛋白和腔內蛋白等研究。產品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能穩(wěn)定，分離產量高。

技術背景

內質網(wǎng)（endoplasmic reticulum；ER）是真核生物的細胞器組分，構成細胞內小管（tubules）、囊泡（vesicles）和小池（cisternae/sac）相互連接的網(wǎng)絡結構，負責蛋白轉譯、折疊和轉運成為細胞膜成分（例如跨膜受體和其它整合膜蛋白等）或分泌型蛋白（例如消化性酶），負責鈣離子區(qū)隔（sequestration），以及糖原、固醇類和其它大分子的生產和儲存等功能。內質網(wǎng)分成三種：粗面內質網(wǎng)（Rough endoplasmic reticulum；RER）、滑面內質網(wǎng)（Smooth endoplasmic reticulum；SER）和肌質網(wǎng)（sarcoplasmic reticulum；SR）。根據(jù)細胞代謝的需要，粗面內質網(wǎng)和滑面內質網(wǎng)會互相轉換。粗面內質網(wǎng)通過核糖體合成蛋白質并分類；滑面內質網(wǎng)進行固醇、碳水化合物代謝等。內質網(wǎng)的分離是現(xiàn)代細胞生物學研究的常用手段之一：第一，通過機械或化學方法破裂組織細胞；第二，通過低速差速離心去除殘渣碎屑和巨大細胞器；第三，通過高速差速離心獲得內質網(wǎng)；甚至，第四，可以通過等密度離心獲得純度更高的內質網(wǎng)。 

產品內容

清理液（Reagent A）        250毫升

平衡液（Reagent B）   250毫升

酶解液（Reagent C）   500微升

裂解液（Reagent D）         40毫升

凈化液（Reagent E）    10毫升

強化液（Reagent F）     5毫升

分離液（Reagent G）    80毫升

保存液（Reagent H）    10毫升

活性液（Reagent I）   200微升

產品說明書 1份

保存方式

保存酶解液（Reagent C）、凈化液（Reagent E）和活性液（Reagent I）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，嚴格避免污染；有效保證6月

用戶自備

50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

6毫升超速離心管：用于超高速離心的容器

4℃臺式離心機：用于樣品制備

4℃超速離心機：用于分離細胞器成分

DOUNCE勻漿器：用于裂解細胞

恒溫水槽：用于孵育反應物

平式搖蕩儀：用于混勻

實驗步驟

實驗開始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent E）和活性液（Reagent I）凍融，然后移出20微升活性液（Reagent I）和1毫升凈化液（Reagent E）到4毫升的裂解液（Reagent D）里，混勻后，置入冰槽里，標記為裂解工作液。然后進行下列操作。

• 準備好50毫升新鮮真菌/酵母菌樣品
• 在分光光度儀上測OD600＝1.0（1 OD＝1 X 10⁷細胞/毫升；總量為5 X 10⁸細胞） 
• 轉移到預冷的50毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• 加入25毫升清理液（Reagent A），混勻
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升平衡液（Reagent B），混勻
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• 加入2毫升平衡液（Reagent B），混勻
• 加入50微升酶解液（Reagent C），混勻
• 放進30℃恒溫水槽孵育60分鐘，期間每隔15分鐘輕輕用手搖勻
• 加入5毫升平衡液（Reagent B），混勻
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升平衡液（Reagent B），混勻
• 放進30℃恒溫水槽孵育30分鐘，繼續(xù)實驗步驟21
• 同時將平衡液（Reagent B）置入冰槽里預冷30分鐘（注意：以下步驟在4℃環(huán)境下進行）
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升預冷的平衡液（Reagent B），混勻
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升含有裂解液（Reagent D）、凈化液（Reagent E）和活性液（Reagent I）的裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻細胞顆粒群
• 選擇下列其中一種方法：

方法一：物理處理法

• 即刻放進預冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿幫勻化細胞（約20至40下）（注意：參見注意事項10）
• 將所有細胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
• 放進4℃超速離心機離心15分鐘，速度為12000g
• 小心移出上清液到預冷的6毫升超速離心管——此步驟獲得后線粒體組分（post mitochondrial fraction；PMF）
• 放進4℃超速離心機再次離心60分鐘，速度為100000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒――此步驟獲得內質網(wǎng)組分
• 如果到此終止，即刻加入1毫升保存液（Reagent H），充分混勻沉淀物
• 轉移到1.5毫升離心管
• 放進－70℃冰箱里保存
• 或如果繼續(xù)分離，按照下列選擇步驟操作
• （選擇步驟）加入4毫升分離液（Reagent G），混勻顆粒群
• （選擇步驟）轉移到15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）再加入4毫升分離液（Reagent G）
• （選擇步驟）置于冰槽里
• （選擇步驟）放在平式搖蕩儀上混勻15分鐘，速度為100RPM
• （選擇步驟）放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為8000g
• （選擇步驟）移取上清液到2個預冷的6毫升超速離心管，保留離心后沉淀顆粒――此步驟獲得粗面內質網(wǎng)組分（沉淀顆粒）
• （選擇步驟）加入500微升保存液（Reagent H），充分混勻沉淀物
• （選擇步驟）即刻轉移到1.5毫升離心管
• （選擇步驟）放進超速離心管到4℃超速離心機再次離心60分鐘，速度為100000g
• （選擇步驟）小心抽去上清液，保留沉淀顆粒――此步驟獲得滑面內質網(wǎng)組分
• （選擇步驟）分別加入250微升保存液（Reagent H），充分混勻沉淀物
• （選擇步驟）即刻合并轉移到1.5毫升離心管
• （選擇步驟）全部放進－70℃冰箱里保存

方法二：化學處理法

• 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
• 加入預冷的500微升強化液（Reagent F）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項11）
• 加入預冷的5毫升裂解液（Reagent D），輕輕搖動試管混勻
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
• 放進4℃超速離心機離心20分鐘，速度為12000g
• 小心移出上清液到預冷的6毫升超速離心管——此步驟獲得后線粒體組分（post mitochondrial fraction；PMF）
• 放進4℃超速離心機再次離心60分鐘，速度為100000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒――此步驟獲得內質網(wǎng)組分
• 如果到此終止，即刻加入1毫升保存液（Reagent H），充分混勻沉淀物
• 轉移到1.5毫升離心管
• 放進－70℃冰箱里保存
• 或如果繼續(xù)分離，按照下列選擇步驟操作
• （選擇步驟）加入4毫升分離液（Reagent G），混勻顆粒群
• （選擇步驟）轉移到15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）再加入4毫升分離液（Reagent G）
• （選擇步驟）置于冰槽里
• （選擇步驟）放在平式搖蕩儀上混勻15分鐘，速度為100RPM
• （選擇步驟）放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為8000g
• （選擇步驟）移取上清液到2個預冷的6毫升超速離心管，保留離心后沉淀顆粒――此步驟獲得粗面內質網(wǎng)組分（沉淀顆粒）
• （選擇步驟）加入500微升保存液（Reagent H），充分混勻沉淀物
• （選擇步驟）即刻轉移到1.5毫升離心管
• （選擇步驟）放進超速離心管到4℃超速離心機再次離心60分鐘，速度為100000g
• （選擇步驟）小心抽去上清液，保留沉淀顆粒――此步驟獲得滑面內質網(wǎng)組分
• （選擇步驟）分別加入250微升保存液（Reagent H），充分混勻沉淀物
• （選擇步驟）即刻合并轉移到1.5毫升離心管
• （選擇步驟）全部放進－70℃冰箱里保存

注意事項

• 本產品為10次操作（50毫升菌液：1克細胞濕重或5 X 10⁸細胞）
• 其它實際操作的細胞量與試劑使用量按比例調整：例如10毫升菌液（OD600=1）：試劑用量是標準用量的五分之一
• 操作時，須戴手套
• 50毫升（OD600＝1）菌液濕重約1克
• 細胞生長條件影響線粒體的質量：建議在有氧條件下富含葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)
• 實驗步驟20以下的所有操作均須在4℃或以下狀態(tài)下進行
• 建議使用足夠的細胞量
• 建議嚴格控制操作時間
• 操作時，避免污染母液，尤其是平衡液（Reagent B）、裂解液（Reagent D）、和保存液（Reagent H）
• 通常勻化次數(shù)為20下（或細胞顆粒群消失為止）達到80％的細胞裂解為理想狀態(tài)，但不同菌株的細胞會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細胞裂解程度：完整細胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù)
• 通常孵育5分鐘達到80％的細胞裂解為理想狀態(tài)，但不同菌株的細胞會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升裂解物的細胞裂解程度：完整細胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加孵育時間和渦旋震蕩次數(shù)
• 通常5 X 10⁸細胞的內質網(wǎng)含量為500至1000微克蛋白
• 本產品所獲得的內質網(wǎng)純度和產量最為理想
• 如果需要獲得95％以上純度的內質網(wǎng)，使用真菌/酵母細胞高質純化內質網(wǎng)分離試劑盒－10489.3
• 內質網(wǎng)的標志蛋白是NADPH細胞色素C還原酶（NADPH Cytochrome C Reductase）；建議使用 組織NADPH細胞色素C還原酶活性比色法定量檢測試劑盒－50303.2
• 本公司提供系列亞細胞結構分析試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩(wěn)定
• 本產品經鑒定分離的內質網(wǎng)維持正常活性
• 本產品經鑒定不含污染性蛋白酶和核酶