李春麗 彭興

賽默飛世爾科技（中國）有限公司

 

N-亞硝基化合物是一類很強的化學致癌物質，包括亞硝胺和亞硝酰胺兩大類物質，通常泛稱為亞硝胺。超過300 多種N-亞硝基化合物在一種或多種動物身上顯示出具有致癌作用[1]，并且40 多種動物包括靈長類都是易于感染N-亞硝基化合物而引起癌癥，而且這類強致癌物質在實驗動物體上誘導出的腫瘤在形態(tài)學特點與生化特點上都與相應的人體器官上發(fā)現(xiàn)的腫瘤相似[2]。美國環(huán)境保護局（USEPA）認為N-亞硝基二甲胺（NDMA）在極低的濃度（0.7 ng/L）下就會致癌，已將其列為優(yōu)先控制污染物[3]。許多國家及國際組織都對相應制品中N-亞硝基胺的檢測制定了嚴格的標準[4][5][6]，如中國出臺了GB28482-2012 《嬰幼兒安撫奶嘴安全要求》；歐盟《玩具安全新指令》（2009/48/EC）中，對其中的N-亞硝基胺含量及遷移量有著極為嚴格的規(guī)定。同時，與該指令配套的歐盟協(xié)調(diào)標準EN71-12 要求至少檢測13 種N-亞硝基胺，包括脂肪族亞硝胺、脂環(huán)族亞硝胺及芳香族亞硝胺等。

 

因此開發(fā)出快速、靈敏和準確的N-亞硝胺化合物的測定方法，對衛(wèi)生檢測、削減和控制亞硝胺含量的研究是迫切需要的。使用GC-MS/MS 檢測N-亞硝胺，已有一定程度的應用[7][8]。賽默飛世爾科技的串接氣質聯(lián)用TSQ 8000 Evo 具有高靈敏度、背景干擾小、穩(wěn)定性高等特點。本文以TSQ 8000 Evo 為平臺建立了橡膠及彈性體材料中11 種N-亞硝基胺GC-MS/MS 檢測方法，結合賽默飛世爾科技特有的TraceFinder 軟件系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)分析和報告輸出，實現(xiàn)了數(shù)據(jù)的快速采集及數(shù)據(jù)結果的智能處理。為N-亞硝基胺的痕量檢測提供了強而有力的技術支持。

 

質譜儀：TSQ 8000 Evo 質譜儀（賽默飛世爾科技，美國）；

氣相色譜儀：Trace 1310 氣相色譜配AI 1310 自動進樣器（賽

默飛世爾科技，美國）；

色譜柱：TR-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）毛細管色譜柱；

試劑：正己烷，丙酮，甲醇；均為色譜級

 

1.2.1 氣相方法

程序升溫：程序升溫：35℃（維持 3 min），10℃ /min 到

100℃（維持 1 min），25℃ /min 到 250℃（維

持 3 min）

進樣口溫度：SSL 分流不分流（220℃）with Splitless 不分流模式

載氣流速：1.0 mL/min（恒流）

傳輸線溫度： 250℃

進樣體積：1.0 μL

 

1.2.2 質譜方法

質譜運行時間：19 min

掃描方式：Timed-SRM

碰撞氣壓力：1.0 m Torr 氬氣

SRM 條件見下表：

 

11 種N-亞硝基胺化合物及1 種內(nèi)標物質質譜信息

 

樣品制備成2 mm×2 mm×2 mm 大�。ň鶆蛉�樣）。

 

1.4.1 樣品提取

準確稱取5.00 g（精確到0.01 g）樣品于40 mL 棕色玻璃瓶中，加入30 mL 甲醇，于室溫超聲萃取30 min ，過濾轉移溶液至250 mL 平底燒瓶中；再向樣品中加入20 mL甲醇溶劑，重復超聲和轉移步驟，并用少量甲醇洗滌棕色瓶2-3 次，合并兩次超聲和洗滌溶液；將溶液旋轉蒸發(fā)（35℃ , 150 mbar）至4 mL 左右，于渦旋混勻器上充分旋轉振蕩1 min，樣品溶液轉移至10 mL 具塞離心管中。另取1mL 甲醇分2-3 次洗滌平底燒瓶壁，并于渦旋混勻器上充分旋轉振蕩1 min，合并洗滌液于10 mL 具塞離心管中。

 

1.4.2 凈化

將C18 固相萃取小柱置于固相萃取裝置上，用5 mL 甲醇預淋洗C18 小柱。將樣液注入小柱，流出液收集于離心管中，待樣液液面下降至小柱填料的上層面時，再加入5 mL 甲醇進行洗脫，收集合并全部流出液于離心管中。

 

1.4.3 濃縮

樣液于250 mL 的平底燒瓶中，并用少量甲醇淋洗離心管壁2-3 次，合并洗滌液于平底燒瓶中，將溶液旋轉蒸發(fā)（35℃ , 150 mbar）至4 mL 左右，取下平底燒瓶，于渦旋混勻器上充分旋轉振蕩1 min，然后將平底燒瓶中的樣液轉移溶液至5 mL 棕色容量瓶中。用少量甲醇淋洗平底燒瓶2- 3 次，并于渦旋混勻器上充分旋轉振蕩1 min，合并洗滌液于棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度。經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后進行分析。

 

 

使用TSQ 8000 系列產(chǎn)品特有的軟件平臺TraceFinder，不僅可以實現(xiàn)數(shù)據(jù)快速、批量、自動化采集及處理，還可完成實驗室常用數(shù)據(jù)報告的自動生成，將Database 數(shù)據(jù)庫，Master method 主方法，Instrument method 儀器方法以及AutoSRM 質譜條件自動優(yōu)化軟件之間有機結合。工作流程如圖1 所示。

 

圖1. TraceFinder 工作流程

 

對于大部分常見化合物方法信息，已包含在TraceFinder內(nèi)置數(shù)據(jù)庫中。檢測所涉及的化合物的質譜方法信息可使用TraceFinder 通過Database 進行查詢、編輯、提取并可直接導入儀器方法中使用。這些化合物包括農(nóng)藥、多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯、多溴聯(lián)苯和多溴聯(lián)苯醚、鄰苯二甲酸酯等常見關注化合物。

 

對于11 種N-亞硝基化合物及1 種內(nèi)標物質，在方法建立初期，其色譜質譜條件未知，需要對其相應的色譜、質譜方法優(yōu)化。同樣可以利用TSQ 8000 系列產(chǎn)品所特有的AutoSRM 軟件進行自動優(yōu)化，可實現(xiàn)優(yōu)化后自動生成儀器方法的功能。

 

AutoSRM 程序自動進行以下三個步驟：1. 全掃描分析。通常最強的離子將被作為母離子。2. 對母離子進行子離子全掃。信號最強的子離子。 3. 對選定的母離子/ 子離子對進行碰撞能的優(yōu)化。其工作流程如圖2 所示。

 

 

 

實驗采用的TR-5MS 色譜柱對N-亞硝胺化合物有良好的分離效果，12 種化合物（含1 種內(nèi)標物質）在19 min 的分離時間內(nèi)得到了良好的色譜圖，結果如圖3 所示。

圖3. 12 種化合物色譜圖

 

選取4 種物質（NDPA，NDEA，NDBA，NMphA）配置成混合標準品，考察前處理方法的準確性及回收率。根據(jù)歐盟農(nóng)殘方法準則要求，回收率需在70-120% 之間。實驗以100 μg/kg 濃度水平進行添加回收實驗，測定兩組平行樣品，結果如表1 所示。結果表明，回收率均處于70-120% 之間，方法準確性良好。

 

同時對儀器的穩(wěn)定性進行了考察，將4 種化合物配置成5.0 μg/kg 標樣，連續(xù)進樣6 次，得到相對應的每個目標化合物物的相對標準偏差（RSD），測試儀器的穩(wěn)定性，如表1 所示。4 種化合物RSD 均小于5.0%。結果表明：儀器在低濃度水平（≤ 5 μg/kg）連續(xù)進樣時，儀器穩(wěn)定性良好，滿足痕量檢測需求。

 

表1 回收率實驗結果

 

TraceFinder 軟件可同時實現(xiàn)數(shù)據(jù)采集及數(shù)據(jù)處理，根據(jù)預先設定的定性離子及定量離子，對化合物的檢出結果進行快速、自動化處理，同時實現(xiàn)定性及定量功能。圖4為NDPA 質譜圖信息。

 

按照上述前處理方法對實驗樣品進行處理，以空白樣品基質制備濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、20、50 μg/kg的基質標準曲線，在確定的色譜和質譜條件下進行測定，對測定結果進行分析，研究方法的靈敏度及檢出限。同時選取了兩種市售產(chǎn)品（嬰兒奶嘴及玩具氣球），對其中11 種N-亞硝胺化合物進行了測定。

 

TSQ 8000 Evo 具有靈敏度高和抗干擾能力強的特點，所檢測11 種化合物在較低的濃度水平得到了良好的檢出效果，完全滿足法規(guī)要求，如表2 所示。同時，在兩種實際樣品中均檢出了少量的NDBA 殘留。結果如表3 所示。

 

實驗結果表明TSQ 8000 Evo 在檢測含有痕量亞硝胺樣品時，具有高選擇性、高靈敏度、高穩(wěn)定性和高通量，在有害化合物檢出方面具有優(yōu)異的表現(xiàn)。同時，強大的TraceFinder 軟件集數(shù)據(jù)采集、處理，方法開發(fā)于一體。在簡化實驗操作步驟的同時，實現(xiàn)了對數(shù)據(jù)處理的自動化。TraceFinder 自帶的AutoSRM 軟件，對于未知信息化合物的質譜條件的優(yōu)化開發(fā)，提供了可靠的支撐。

 

 

圖4. NDPA 質譜圖信息（2 μg/kg）

 

表2.《EN 71-12:2013》中設定的安全要求

 

表3. 靈敏度、檢出限及實際樣品測定結果

 

[1] R. Preussmann. Carcinogenic N-nitroso compounds and their environmental significance. [M]

[2] Bogovski P．Bogovski S．Animal species in which N-nitroso compounds induce cancer[J]. International Journal of Cancer,1981，24：471-474．

[3] U.S. Environmental Protection Agency. N-Nitrosodimethylamine (CASRN 62-75-9). http://www.epa.gov/iris/subst/0045.htm

[4] GB 28482-2012 《嬰幼兒安撫奶嘴安全要求》

[5] 歐盟《玩具安全新指令》（2009/48/EC）

[6] EN 71-12:2013 亞硝胺與亞硝胺化合物》

[7] 童玉貴, 林偉, 林中等. 氣質聯(lián)用法測定鞋類橡膠材料中的N- 亞硝基胺含量[J]. 皮革科學與工程. 2011, 5 (21):56-60.

[8] 李丕, 白樺, 李海玉等. 固相萃�。瓪庀嗌�譜－串聯(lián)質譜法測定乳膠兒童用品中15 種N- 亞硝胺及其前體物的遷移量[J]. 色譜. 2014,1 (32): 81-88.