了解代謝組學(xué)研究的影響因素與降低生物化學(xué)和化學(xué)噪音的策略
關(guān)鍵詞
Q Exactive Focus；SIEVE 軟件；生物標(biāo)記物；藥物發(fā)現(xiàn)；代謝組學(xué)
目的
為代謝組學(xué)生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)開(kāi)發(fā)一套全新的自動(dòng)化工作流程和儀器分析方法。
前言
在制藥行業(yè)中，代謝組學(xué)用于研究潛在候選藥物的藥理學(xué) 響應(yīng)所產(chǎn)生的生化變化，其識(shí)別毒性 / 藥效標(biāo)記物的能力可以顯著加速藥物研發(fā)的進(jìn)程并幫助制定合適的臨床計(jì)劃。來(lái)自于 液相色譜 - 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）的代謝輪廓實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，包含大量的化學(xué)噪音，常常干擾生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)。本文采用全新的質(zhì)譜技術(shù)和數(shù)據(jù)處理軟件來(lái)降低動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的化學(xué)背景，進(jìn)而研究藥物誘導(dǎo)的變化與動(dòng)物年齡和營(yíng)養(yǎng)的關(guān)系。
常規(guī) LC-MS 代謝組學(xué)研究存在很多冗余的（一種組分有多個(gè)離子）和不相關(guān)的（化學(xué)噪音）數(shù)據(jù)。同時(shí)影響代謝輪廓的外部因素（年齡、營(yíng)養(yǎng)）增加了生物多變性。由于許多化學(xué)物質(zhì)是未知的，因此，在進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定前過(guò)濾掉假陽(yáng)性結(jié)果尤 為重要。超高分辨率儀器結(jié)合超高效液相色譜（UHPLC）的分離可以提供足夠的分辨率將代謝物與化學(xué)背景區(qū)分開(kāi)，解決了化學(xué)噪音和數(shù)據(jù)冗余的問(wèn)題。準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)能確保識(shí)別相關(guān)信號(hào)所需要的精細(xì)數(shù)據(jù)處理。此技術(shù)可大大減少數(shù)據(jù)量，并改進(jìn)目標(biāo)代謝物的定量。生物因素對(duì)代謝輪廓有著深遠(yuǎn)的影響，即使細(xì)小的代謝變化也會(huì)掩蓋藥物誘導(dǎo)的代謝效應(yīng)。了解大鼠的正常代謝變化能使“生物噪音”降到最低，并提供更為可靠的藥物相關(guān)的代謝變化信息。
實(shí)驗(yàn)部分
樣品前處理
抽取各組雄性大鼠（飽食，急慢性禁食，不同年齡）的 血液樣品并進(jìn)行 LC-MS 分析。取 50 µL 血清樣品，加入 100 µL 含 0.1% 甲酸的冷甲醇溶液以除去蛋白質(zhì)。干燥樣品，加入 200 µL10%甲醇水溶液復(fù)溶。每份樣品中加入N-苯甲�；�-D5甘氨酸（tR = 4.27 min， m/z 185.0969）作為內(nèi)標(biāo)。
液相色譜
采用Thermo ScientificTM Open AccelaTM 1250 UHPLC 系統(tǒng) 和 Thermo ScientificTM Hypersil GOLDTM aQ 色譜柱（150 × 2.1 mm, 1.9 µm粒徑）進(jìn)行色譜分離。進(jìn)樣量為3 µL。色譜條件如下：
質(zhì)譜
采用Thermo ScientificTM Q ExactiveTM Focus Hybrid QuadrupoleOrbitrap 質(zhì)譜儀（圖 1）分別在正離子和負(fù)離子模式下采集得到高 分辨率準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)（HRAM）數(shù)據(jù)，分辨率為 70,000（FWHM）。
數(shù)據(jù)處理
采用Thermo ScientificTM SIEVETM 軟件的組分提取 （Component Extraction, CE）數(shù)據(jù)處理算法分析數(shù)據(jù)，測(cè)定大鼠禁食產(chǎn)生的代謝效應(yīng)。
結(jié)果與討論
圖 2 顯示了N- 苯甲�；�-D5- 甘氨酸內(nèi)標(biāo)物的高質(zhì)量 LC-MS 數(shù)據(jù)。在質(zhì)量軸校準(zhǔn)后的25 到 35 小時(shí)之間采集血清 QC 重復(fù)樣的正離子模式數(shù)據(jù)，展示了 UHPLC 分析時(shí)間內(nèi)優(yōu)異 的峰面積和質(zhì)量數(shù)測(cè)定的穩(wěn)定性�；�處的色譜峰寬為 3.6 s， 每個(gè)峰獲得了 15 次掃描。 圖 3 顯示了測(cè)定內(nèi)源代謝物的元素組成時(shí)分辨率為 70,000 的重要性。A+2 同位素（ m/z 313）附近的展開(kāi)圖中顯 示存在一個(gè) 34S，這在 35,000 分辨率下（模擬）是不可能發(fā)現(xiàn) 的，因?yàn)榉直媛瘦^低時(shí)，13C2 同位素與 34S 是不能分辨的。
組分提取軟件的數(shù)據(jù)處理工作流程如圖 4 所示。該軟件能像分析人員一樣解析數(shù)據(jù)，批量處理各個(gè)數(shù)據(jù)文件，而不是單獨(dú)處理，并將每次運(yùn)行得到的信息用于驗(yàn)證下一次運(yùn)行獲得的信息。按照這種方式，由于每種組分在數(shù)據(jù)集中的最大濃度點(diǎn)定義，從而大大減小了數(shù)據(jù)缺失值現(xiàn)象。同樣的組分在低濃度樣品中時(shí)，可以采用更靶標(biāo)性的方法實(shí)現(xiàn)鑒定和定量。
實(shí)驗(yàn)得到高度簡(jiǎn)化的數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)處理去除了系統(tǒng)產(chǎn)生的大量噪音，得到了更嚴(yán)格的統(tǒng)計(jì)學(xué)分組和更可靠的差異分析和組分推斷結(jié)果。
表 1 中的大鼠研究實(shí)驗(yàn)用于監(jiān)測(cè)禁食對(duì)大鼠代謝過(guò)程的影 響。圖 5 顯示了喂養(yǎng)大鼠控制樣組、混合 QC 樣和禁食 4、12 和16小時(shí)血清樣主成分分析（PCA）的高質(zhì)量聚類分析結(jié)果。結(jié)果清晰地顯示了喂養(yǎng)和禁食大鼠血清代謝組的區(qū)別，以及不 同禁食時(shí)間的代謝組差異。圖6 顯示了隨禁食時(shí)間變化增加 （Met 甲硫氨酸，20:4 FA 二十碳四烯酸）和減少（Pro 脯氨酸， 18:2 LPC 溶血磷脂酰膽堿）的代謝物。如圖6 所示，混合血 清 QC 重復(fù)樣中的每種代謝物均呈現(xiàn)極佳的重現(xiàn)性。因此，沒(méi) 有必要做技術(shù)性重復(fù)樣。圖 7 說(shuō)明在實(shí)際 LC-MS 分析中，盡 管正離子和負(fù)離子模式的運(yùn)行時(shí)間相隔 30 小時(shí)，血清中尿酸 的測(cè)定結(jié)果在兩種模式下仍然一致。研究證實(shí)，該 LC-MS 平臺(tái)和方法非常耐用。從而推斷生物多變性是這些數(shù)據(jù)中噪音的主要來(lái)源。
結(jié)論
Q Exactive Focus 質(zhì)譜儀為非靶標(biāo)代謝組學(xué)研究提供了一 種精密和耐用的平臺(tái)。此平臺(tái)擁有與 UHPLC 兼容的超快掃描速度，能在外標(biāo)法校準(zhǔn)后的相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)，在正離子和負(fù)離子兩種模式下均保持優(yōu)異的質(zhì)量數(shù)準(zhǔn)確度和響應(yīng)值穩(wěn)定性。不需 要做技術(shù)性重復(fù)樣。高達(dá) 70,000 FWHM 的分辨能力能測(cè)定精細(xì)同位素輪廓，有助于清晰地推斷元素組成。若要消除研究中 大量的噪音干擾，可以采用 SIEVE 軟件中的智能化數(shù)據(jù)簡(jiǎn)化工具來(lái)實(shí)現(xiàn)化學(xué)噪音的顯著降低。此外，系統(tǒng)化的研究有助于生物噪音的表征，同時(shí)代謝組學(xué)預(yù)篩選功能幫助鑒定出生物離群值，從而確保整個(gè)研究的一致性。
如本研究所示，禁食是模型設(shè)計(jì)中的一個(gè)顯著變量，禁食數(shù)據(jù)有助于分析很多由藥物引起的代謝物變化。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠禁食對(duì)代謝輪廓分析有著深遠(yuǎn)的影響。雖然大多數(shù)代謝變化
在一定程度上是比較細(xì)微的，但是禁食能突顯或掩蓋掉一些藥物引起的代謝影響。
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