聶愛英

賽默飛世爾科技（中國）有限公司

 

Orbitrap Fusion；LTQ-Orbitrap系列質(zhì)譜；融合蛋白Enbrel；ETD-triggered CID；二硫鍵分析

 

融合蛋白 Enbrel (Etanercept) 是由人的腫瘤壞死因子（TNF，Tumornecrosis factor）膜外受體部分和人的免疫球蛋白（IgG1）的 Fc 部分融合而成，是一種人源 TNF-α 受體抗體融合蛋白，是腫瘤壞死因子（TNF-α）的拮抗劑，它通過抑制 TNF-α 可以起到控制炎癥、阻斷病情進(jìn)展的作用，它屬 DMARD 類藥物，可用于活動性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、牛皮癬及關(guān)節(jié)性牛皮癬、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、及活動性強(qiáng)直性脊柱炎。

 

二硫鍵作為共價鍵交聯(lián)多肽鏈內(nèi)或鏈間的兩個半胱氨酸，對于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)、維持正確的空間折疊構(gòu)象、保持及調(diào)節(jié)其生物活性等都起著舉足輕重的作用，尤其對于生物藥品，二硫鍵的位置和連接情況對于生物藥物的空間結(jié)構(gòu)、藥物活性等起著關(guān)鍵的作用。目前，常用的定位二硫鍵的方法主要分為X射線衍射晶體結(jié)構(gòu)解析法、多維核磁共振法、二硫鍵異構(gòu)及突變分析法、酶解法和化學(xué)裂解法等，這些方法都各具特色，也各有局限性。隨著質(zhì)譜儀器在質(zhì)量檢測范圍、分辨率、靈敏度、準(zhǔn)確度和分析速度等方面的不斷發(fā)展，從而使得質(zhì)譜分析法更加適用于二硫鍵的定位分析中。目前，常用的質(zhì)譜碎裂技術(shù)，包括碰撞誘導(dǎo)解離（CID）、高能碰撞解離（HCD）和電子轉(zhuǎn)移解離（ETD）等都可以直接應(yīng)用到二硫鍵的碎裂分析中，不過不同的碎裂模式對于化學(xué)鍵的斷裂各有特點：ETD 更加易于肽段間的二硫鍵斷裂，而 CID 更加易于肽段中肽鍵的斷裂，因此將二者聯(lián)用起來，也就是 ETD-triggered CID 的方法，可以首先通過 ETD 打開肽段間的二硫鍵，得到二硫鍵的連接信息，然后采用 CID 將解離開的肽段分別進(jìn)行碎裂，從而得到肽段的氨基酸序列，這樣就可以在一次實驗中，得到完整的二硫鍵的定位信息，如圖 1 所示。

 

目前，最新的 Orbitrap Fusion 和 LTQ-Orbitrap 系列的組合式質(zhì)譜儀都結(jié)合了最新的雙壓線性離子阱質(zhì)譜儀和新型高場 Orbitrap^TM 質(zhì)量分析器，可以提供超高的分辨率、超高的靈敏度、快速的掃描速度和更大的動態(tài)范圍，并且可以在同一臺質(zhì)譜上同時實現(xiàn)低分辨和高分辨掃描，從而都可以進(jìn)行以上的二硫鍵定位分析，為各種蛋白質(zhì)樣品，特別是各種生物藥產(chǎn)品，比如單抗、融合蛋白等提供了準(zhǔn)確、快速、可靠的分析測試方法與平臺。

 

圖 1. 應(yīng)用于二硫鍵定位分析的 ETD-triggered CID 實驗示意圖（HR 表示高分辨掃描，LR 表示低分辨掃描）

 

質(zhì)譜儀器：Orbitrap Fusion（賽默飛世爾科技，美國）；

色譜儀器：Easy Nano1000液相色譜系統(tǒng)（賽默飛世爾科技，美國）；

色譜柱：自制反相色譜柱（C18，2 μm，75×150 μm，100 Å）；

試劑：色譜級甲酸、二次去離子水，色譜級乙腈。

 

2.2 儀器方法

色譜分析條件：具體見表 1；

質(zhì)譜分析條件：具體見表 2；

 

表 1. 融合蛋白二硫鍵分析的色譜條件

 

表 2. 融合蛋白二硫鍵分析的質(zhì)譜條件

 

使用 Proteome Discoverer 1.3 軟件對原始譜圖進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索，具體參數(shù)如下，流程圖如圖 2 所示：

數(shù)據(jù)庫：融合蛋白對應(yīng)的氨基酸序列；

一級質(zhì)量偏差：20 ppm；二級質(zhì)量偏差：0.02 Da；三級質(zhì)量偏差：0.8 Da；

酶：trypsin+Chymotryspin；

酶漏切位點：2；

 

圖 2. Proteome Discoverer 1.3 軟件對 ETD-triggered CID 原始數(shù)據(jù)進(jìn)行二硫鍵定位分析的流程示意圖

 

a. 色譜質(zhì)譜提取流圖如下所示：

 

 

由上圖可以看出，該肽段對應(yīng)的一級母離子在 13.96 min 洗脫出來，相應(yīng)的質(zhì)量偏差在 5.4 ppm。

b. ETD 二級碎裂匹配圖

 

 

由上圖可以看到，二硫鍵連接的兩條肽段在經(jīng)過 ETD 碎裂后，不僅產(chǎn)生了相應(yīng)的兩條肽段的碎片離子，而且也同時產(chǎn)生了二硫鍵連接在一起的其它碎片離子信息。

 

c. CID 三級碎裂匹配圖

 

 

 

由上圖可以看到，ETD 碎裂產(chǎn)生的肽段 P1 和 P2 在后續(xù)的三級 CID 碎裂中，產(chǎn)生大量的 b、y 碎片離子，可以有效的確定肽段 P1 和 P2 的組成，并且結(jié)合 ETD 的信息，從而確定肽段 P1 和 P2 之間通過二硫鍵被連接在一起。

 

a. 色譜質(zhì)譜提取流圖如下所示：

 

 

由上圖可以看出，該肽段對應(yīng)的一級母離子在 30.42 min 洗脫出來，相應(yīng)的質(zhì)量偏差在 0.4 ppm。

b. ETD 二級碎裂匹配圖

 

 

由于受到目前軟件的限制，對同一張 ETD 碎裂譜圖，我們根據(jù)不同的二硫鍵連接分別進(jìn)行了兩次碎片離子標(biāo)記，可以觀察到肽段 P1、肽段 P1-P2、肽段 P3 和肽段 P2-P3，如上所示。可以看到通過 ETD 碎裂，不僅產(chǎn)生了相應(yīng)的兩條肽段的碎片離子，而且也同時產(chǎn)生了二硫鍵連接在一起的其它碎片離子信息。

 

c. CID 三級碎裂匹配圖

 

 

由上圖可以看到，ETD 碎裂產(chǎn)生的肽段 P1 和 P3 在后續(xù)的三級 CID 碎裂中，產(chǎn)生大量的 b、y 碎片離子，因此可以確定肽段 P1 和 P3 的存在。 從結(jié)果中發(fā)現(xiàn)肽段 P2 未被有效的鑒定，這可能是由于鏈間二硫鍵的存在或者是在二硫鍵碎裂的過程中，發(fā)生了其它化學(xué)鍵的碎裂或者連接所導(dǎo)致，不過通過以上的 ETD 和 CID 碎片信息，可以判斷這三條肽段之間確實存在兩對鏈間二硫鍵。

 

本文通過 Orbitrap-Fusion 質(zhì)譜建立了 ETD-triggered CID 的二硫鍵分析測試方法，并且在融合蛋白的樣品中進(jìn)行了實際樣品分析，由于酶切位點的局限性，目前采用胰酶和糜蛋白酶的酶解方法，可以準(zhǔn)確確定大部分存在的二硫鍵連接信息，同時還可以提供二硫鍵錯配的信息，為單抗、融合蛋白等生物藥品的二硫鍵分析提供了有效的分析測試方法和平臺。除此之外，Orbitrap-Fusion 和 LTQ-Orbitrap 系列的組合式質(zhì)譜儀，憑借其超高的分辨率、超快的掃描速度和超高的質(zhì)量精度，并且結(jié)合靈活多樣的方法設(shè)置和多種碎裂方式，極大地完善和推動了生物制藥行業(yè)的質(zhì)譜深入鑒定和定量分析。