聶愛英
賽默飛世爾科技(中國)有限公司
關(guān)鍵詞
LTQ-Orbitrap Elite;核酸藥物;分子質(zhì)量測定
1. 前言
隨著人們對核酸結(jié)構(gòu)和功能的深入了解,特異性結(jié)合或者裂解致病基因的核酸藥物也逐漸成為了藥物研究的新熱點(diǎn), 核酸藥物的作用效率高、應(yīng)用范圍廣,可以對傳統(tǒng)藥物進(jìn)行補(bǔ)充,并且在前期的臨床診斷中也可以起到重要的指示作用。核酸藥物主要是指各種具有不同功能的寡聚核糖核苷酸(RNA)或者寡聚脫氧核糖核甘酸(DNA),主要作用于基因水平,在信息流傳遞的上游階段起作用,效率比較高,且通過結(jié)合或者裂解特異性的致病基因,而對其它基因沒有任何影響。在信息流的傳遞過程中,信號逐級放大,一個基因可以轉(zhuǎn)錄出多個 mRNA,一個 mRNA 又可以翻譯出多個蛋白質(zhì),所以與作用于信息流最終產(chǎn)物-蛋白質(zhì)相比,核酸藥物具有廣泛的應(yīng)用前景。目前的核酸藥物可以與一些轉(zhuǎn)錄因子、凝血酶、人類免疫缺陷病毒、雙鏈 DNA 的特殊部位等結(jié)合,從而抑制 DNA 的復(fù)制或者蛋白、受體等的結(jié)合,從而干擾和阻止病毒或者錯誤基因和蛋白的表達(dá)和放大,因此在基因藥物的研發(fā)和生產(chǎn)過程中,建立和發(fā)展一種更有效、靈敏、快速和精確的寡聚核苷酸的結(jié)構(gòu)和序列分析方法,一直都是生物化學(xué)家、醫(yī)藥工作者和儀器分析公司的研究課題之一。
生物質(zhì)譜的技術(shù)為寡聚核苷酸的分子質(zhì)量和序列分析提供了新的途徑。之前,基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行質(zhì)譜(MALDI-TOF)主要用于分子質(zhì)量比較小的寡聚核苷酸分析,受儀器的靈敏度,分辨率,堿金屬離子加合峰的影響,測試的精確度和可靠性都存在一定問題。另外,基于常規(guī)的電噴霧離子阱(Ion Trap)質(zhì)譜的檢測,同樣受限于分辨率與質(zhì)量精度,也無法滿足高精度、高分辨、高靈敏的寡聚核苷酸的檢測分析。
LTQ-Orbitrap Elite 組合式質(zhì)譜儀結(jié)合了最新的雙壓線性離子阱質(zhì)譜儀和新型高場 OrbitrapTM 質(zhì)量分析器,可以提供高達(dá)240,000 的分辨率(FWHM)、高靈敏度、快速的掃描速度和更大的動態(tài)范圍,并且可以在同一臺質(zhì)譜上可以同時實現(xiàn)低分辨和高分辨掃描,滿足客戶的不同需求。該系統(tǒng)可以為寡聚核苷酸的分子質(zhì)量測定提供準(zhǔn)確、快速、可靠的分析測試。
2. 實驗部分
2.1 儀器和試劑
質(zhì)譜儀器:LTQ-Orbitrap Elite(賽默飛世爾科技,美國);
色譜儀器:Accela 液相色譜系統(tǒng)(賽默飛世爾科技,美國);
色譜柱:BioBasic 色譜柱(C8, 2.1×50 mm,5 μm,300 Å)(賽默飛世爾科技,美國);
試劑:乙酸銨、二次去離子水,色譜級甲醇。
2.2 儀器方法
色譜分析條件:具體見表 1;
質(zhì)譜分析條件:具體見表 2;
表 1. 寡聚核苷酸分子質(zhì)量測定的色譜分析條件
表2寡聚核苷酸分子質(zhì)量測定的質(zhì)譜分析條件
2.3 數(shù)據(jù)分析方法
采用 ProMass 軟件對原始質(zhì)譜圖進(jìn)行去卷積處理,得到完整的寡聚核苷酸的分子質(zhì)量信息。
3. 結(jié)果與討論
3.1 低分辨 LTQ 質(zhì)量檢測器測定寡聚核苷酸的分子質(zhì)量
3.1.1 原始色譜質(zhì)譜圖
采用 5 min 的梯度分析,離子阱采集數(shù)據(jù),寡聚核酸主要在 3.53 min 出峰。
3.1.2 原始質(zhì)譜圖
將上圖中 3.53 min 附件的寡聚核苷酸譜圖信號平均后,得到該寡聚核苷酸的平均質(zhì)譜圖,由于 LTQ 的分辨率有限,無法將電荷直接分辨出來,因此需要通過軟件進(jìn)行去卷積處理,從而得到該寡聚核苷酸的分子質(zhì)量。
3.1.3 去卷積之后的質(zhì)譜結(jié)果
通過 ProMass 軟件去卷積之后的平均分子質(zhì)量為 9247.3,與理論的平均分子質(zhì)量完全一致,并且 ProMass 軟件對原始質(zhì)譜圖中質(zhì)譜峰的電荷進(jìn)行了歸屬,如下所示,質(zhì)荷比為 1540.2 的質(zhì)譜峰對應(yīng)的電荷為 –6 價,質(zhì)荷比為 1848.5 的質(zhì)譜峰對應(yīng)的電荷為–5 價。
3.2 高分辨 Orbitrap 質(zhì)量分析器測定寡聚核苷酸的分子質(zhì)量
3.2.1 原始色譜質(zhì)譜圖
與低分辨的實驗相比,在保持上樣量和色譜條件不變的前提下,僅僅改變質(zhì)譜采集的分辨率,可以看到寡聚核苷酸的色譜保留時間不變,基本在 3.52 min 出峰,不過隨著質(zhì)譜檢測器分辨率的提高,原始質(zhì)譜圖發(fā)生了顯著的變化,如下所示,當(dāng)使用線性離子阱 LTQ 作為質(zhì)量檢測器時,只檢測到一個大包峰,無法分辨電荷;當(dāng)使用 Orbitrap 作為質(zhì)量檢測器,分辨率 R 設(shè)置為 15000 時,同樣也只檢測到一個大包峰,電荷仍然無法分辨;當(dāng)使用 Orbitrap 作為質(zhì)量檢測器,分辨率 R 設(shè)置為 30,000 時,可以觀察到一些同位素峰,電荷可以實現(xiàn)分辨;當(dāng)使用 Orbitrap 作為質(zhì)量檢測器,分辨率 R 設(shè)置為 60,000 時,可以觀察到稍微好一些的同位素峰,但無法完全分離,電荷同樣可以實現(xiàn)分辨;當(dāng)使用 Orbitrap 作為質(zhì)量檢測器,分辨率 R 設(shè)置為 120,000 時,同位素峰可以實現(xiàn)完全分離,電荷同樣也可以實現(xiàn)分辨;當(dāng)使用 Orbitrap 作為質(zhì)量檢測器,分辨率 R 設(shè)置為 240,000 時,同位素峰可以實現(xiàn)完全分離,并且峰形更加尖銳,電荷同樣也可以實現(xiàn)分辨,由此我們可以準(zhǔn)確的計算得到寡聚核苷酸的單同位素質(zhì)量和平均質(zhì)量,最后的實驗結(jié)果與理論預(yù)測的分子質(zhì)量保持完全一致。
同樣,我們對幾個不同分子質(zhì)量的寡聚核苷酸進(jìn)行了不同分辨率的質(zhì)譜測試,結(jié)果如下所示:
從上面的質(zhì)譜圖中,可以看到,隨著質(zhì)譜分辨率的提高,寡聚核苷酸的同位素峰可以實現(xiàn)完全分離,并且峰寬更窄,電荷也可以實現(xiàn)完全分辨,并且無需軟件輔助,就可以直接計算得到寡聚核苷酸的單同位素質(zhì)量和平均分子質(zhì)量,使得寡聚核苷酸的分析測試更加快速和直接。
4. 結(jié)論
本文通過 LTQ-Orbitrap Elite 質(zhì)譜建立了寡聚核酸藥物分子質(zhì)量分析的色譜質(zhì)譜在線方法,可以在核酸藥物的研發(fā)分析和實時生產(chǎn)檢測中,更加有效、靈敏、快速和精確的測定寡聚核苷酸的分子質(zhì)量。實驗結(jié)果表明 LTQ-Orbitrap Elite 組合式質(zhì)譜儀,憑借其超高的分辨率,超快的掃描速度,超高的質(zhì)量精度、超低的靈敏度和超大的動態(tài)范圍,極大地完善和推動了基因藥物的鑒定分析。