李靜

賽默飛世爾科技（中國）有限公司色譜質(zhì)譜部

楊淑君 韓念和 薦立

上海新理念生物醫(yī)藥科技有限公司

 

Exactive Plus EMR；ADCs；cysteine -linked ADCs；Native MS

 

單克隆抗體被認(rèn)為是具有高度特異性的靶向藥物，其對腫瘤細胞的靶向性非常高。而抗體- 藥物偶聯(lián)物（Antibody-drug conjugates，以下簡稱ADCs）技術(shù)，就是在抗體蛋白的特定氨基酸上偶聯(lián)具有抗腫瘤作用的高效應(yīng)化療藥物（或稱小分子藥物），以增加單克隆抗體的療效、并降低小分子藥物的毒性。相比單克隆抗體，ADCs 藥物的生產(chǎn)工藝更為復(fù)雜，因此為了保證ADCs 藥物的安全性和有效性，需對ADCs 藥物的質(zhì)量進行監(jiān)控。藥物抗體比（drug to antibody ratio，以下簡稱DAR）是評價ADCs 藥物的生產(chǎn)工藝和產(chǎn)品質(zhì)量的一個重要參數(shù)。目前大部分上市和在研ADCs 藥物主要包括基于抗體自身的賴氨酸進行偶聯(lián)的ADCs 藥物（lysine-linked ADCs）和基于抗體自身鏈間二硫鍵經(jīng)還原后的半胱氨酸進行偶聯(lián)的ADCs 藥物（cysteine -linked ADCs）（圖1）。兩類ADCs 的DAR 測定通常有UV、HIC和MS三種方法，其中MS檢測方法因其快速、靈敏度高和強大的定性功能等優(yōu)點，愈來愈廣泛地被用于測定ADCs 的DAR。目前MS 用于測定ADCs 的DAR 通常是基于傳統(tǒng)的RPLC/MS 平臺，該平臺下RPLC 采用的流動相呈酸性，且含有較高濃度的乙腈，蛋白在此條件下大多發(fā)生變性， 因此測定結(jié)果嚴(yán)格意義上講反映的是ADCs 變性后的DAR。對于lysine-linked ADCs 而言，上述變性條件不影響其抗體結(jié)構(gòu)的完整性，故RPLC/MS 平臺不影響其DAR 測定。然而， 對于cysteine-linked ADCs 而言，上述變性條件破壞了維持抗體空間結(jié)構(gòu)的非共價作用，ADCs 部分解離其輕鏈或重鏈，故RPLC/MS 平臺無法用于其DAR 測定。隨著非變性質(zhì)譜（Native MS）技術(shù)的不斷發(fā)展和推廣，采用非變性質(zhì)譜進行cysteine-linked ADCs 分析顯示了強大的應(yīng)用潛力。

 

Thermo ScientificTM ExactiveTM Plus EMR 質(zhì)譜儀保持了Orbitrap 高分辨率、高質(zhì)量精度的優(yōu)勢，同時擴展質(zhì)量數(shù)范圍至m/z 20000，并且在硬件設(shè)計上提升高質(zhì)量端離子的傳輸效率，改進了HCD 壓力，使其更加適用于完整蛋白質(zhì)的分析。

 

適用于保留有三級和四級結(jié)構(gòu)的非變性蛋白質(zhì)和蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)學(xué)、拓撲學(xué)研究以及生物制藥中非變性狀態(tài)下cysteine-linked ADCs 的分析。

 

本實驗建立了基于ExactiveTM Plus EMR 和Protein Deconvolution 3.0 軟件的非變性狀態(tài)下蛋白質(zhì)的分析流程（圖2），并成功用于cysteine-linked ADCs 的分析，測定載有不同藥物分子數(shù)的ADCs混合物的精確分子量，并測定其DAR值。

圖1 Cysteine-linked ADCs 示意圖

 

圖2 非變性狀態(tài)Cysteine-linked ADCs 的分析流程

 

 

樣品PCT為Cysteine-linked ADCs，PNGase F去糖基化后，采用Micro Bio-Spin® Chromatography Columns進行緩沖溶液交換，保存于100 mM 乙酸銨（pH 7.0）中，配制成濃度為5.5 μM的溶液備用。

 

 

采用Thermo Scientific^TM Protein Deconvolution 3.0對原始質(zhì)譜圖進行去卷積。

 

參數(shù)如下：

 

 

 

本實驗通過直接進樣方式，分別設(shè)置Orbitrap分辨率為17500，35000，70000， ADCs藥物的原始質(zhì)譜圖如圖3，ADCs藥物的質(zhì)譜峰主要分布在m/z 5000-7000范圍內(nèi)，具有理想的信噪比。選取兩組質(zhì)譜峰進行放大（圖4所示）可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)逐漸提高質(zhì)譜分辨率時，主峰逐漸與加合離子峰分離。分辨率越高，分離效果越明顯。

 

經(jīng)Protein Deconvolution 3.0軟件去卷積處理之后的不同分辨率下的ADCs藥物分子質(zhì)量分布如圖5所示，根據(jù)ADCs藥物單抗的氨基酸序列和小分子藥物的理論分子量進行計算，將觀察到的質(zhì)譜峰進行歸屬，從圖中我們觀察到，五個主峰呈現(xiàn)等質(zhì)量間隔（約2635Da），由此可推斷該單抗分子結(jié)合了不同數(shù)目的藥物小分子。結(jié)合cysteine-linked ADCs的特點，判斷主峰依次為結(jié)合了0、2、4、6、8個小分子藥物的ADCs混合物，該結(jié)果與理論預(yù)期一致。

 

 

圖3 不同分辨率設(shè)置下（17500，35000，70000）ADCs藥物的原始質(zhì)譜圖

 

 

圖4 不同分辨率設(shè)置下（17500，35000，70000）ADCs藥物局部放大質(zhì)譜圖

 

 

圖5 不同分辨率設(shè)置下（17500，35000，70000）ADCs藥物去卷積后結(jié)果

 

 

表1不同分辨率（17500，35000，70000）下去卷積后的精確分子量和質(zhì)量偏差

 

不同分辨率（17500，35000，70000）下去卷積后的精確分子量如表1所示，比較發(fā)現(xiàn)，當(dāng)分辨率設(shè)置為17500時，由于無法實現(xiàn)主峰和加合離子峰的有效分離，質(zhì)量與理論值偏差較大，最大偏差達到7.7Da。當(dāng)分辨率逐漸提升到35000，主峰逐漸與加合離子峰分離，質(zhì)量偏差控制在0.3-1.6Da，具有極佳的質(zhì)量準(zhǔn)確度。當(dāng)分辨率逐漸進一步提升到70000時，主峰與加合離子峰分離度進一步提高，同樣可獲得理想的質(zhì)量準(zhǔn)確度（0.2-2.7Da），滿足測定需求。

 

根據(jù)質(zhì)譜峰的峰強度信息，可計算該藥物的DAR值，該數(shù)值對于ADCs藥物的有效性評估至關(guān)重要。以分辨率設(shè)置35000下質(zhì)譜圖去卷積結(jié)果為例（如圖6所示），按照DAR = Σ(relative peak area×number of loaded drugs)/100計算DAR值，獲知該ADCs藥物DAR=3.9。

 

 

圖6 分辨率設(shè)置35000下質(zhì)譜圖去卷積后ADCs藥物質(zhì)量分布圖（D0-D8表示載有不同藥物分子數(shù)的ADCs混合物）

 

本文采用Exactive Plus EMR質(zhì)譜儀，直接進樣方式，突破了傳統(tǒng)的RPLC/MS平臺無法進行cysteine-linked ADCs分析的瓶頸，建立了cysteine-linked ADCs的精確分子量測定方法，為cysteine-linked ADCs 單抗藥物研發(fā)和生產(chǎn)檢測提供了高效、快速的分析平臺。實驗結(jié)果表明Exactive Plus EMR質(zhì)譜儀憑借其超高的分辨率、超快的掃描速度、超高的質(zhì)量精度、超高的靈敏度以及拓展的質(zhì)量范圍，極大地完善和推動了ADCs藥物的鑒定分析。

 

1. Albert J R Heck et al. Nat. Methods 2008, 5(4), 927-933.

2. Sara Rosati et al. Nature Protocols 2014,9(4) , 967-976