高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定血漿中的替加環(huán)素

 

周 亮

賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司

 

替加環(huán)素（Tigecycline）又名9- 叔丁基甘氨酰胺基米諾環(huán)素、丁甘米諾環(huán)素，是首個(gè)被批準(zhǔn)用于臨床的靜脈內(nèi)給藥的甘氨酰四環(huán)素類抗生素，具有超廣譜的抗菌活性，包括革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性的好氧菌及厭氧菌等臨床分離的重要致病菌。替加環(huán)素的作用機(jī)制與四環(huán)素類抗生素相似，都是通過(guò)與細(xì)菌30S 核糖體結(jié)合，阻止轉(zhuǎn)移RNA的進(jìn)入，使得氨基酸無(wú)法結(jié)合成肽鏈，最終起到阻斷細(xì)菌蛋白質(zhì)合成，限制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用。替加環(huán)素能夠克服或限制細(xì)菌的外排泵和核糖體保護(hù)兩種耐藥機(jī)制的作用，不易產(chǎn)生耐藥性，其廣泛的組織分布和較長(zhǎng)的清除半衰期的藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)令人樂(lè)觀；同時(shí)對(duì)于腎功能紊亂及需進(jìn)行血液透析的患者，不必進(jìn)行劑量和時(shí)間上的調(diào)整。2005 年6 月美國(guó)FDA 批準(zhǔn)用于成人復(fù)雜皮膚及軟組織感染和成人復(fù)雜的腹內(nèi)感染，但在國(guó)內(nèi)尚處于臨床研究、申報(bào)生產(chǎn)階段。

 

 

本實(shí)驗(yàn)建立了測(cè)定血漿中替加環(huán)素的LCMSMS 方法，采用適當(dāng)?shù)臉悠非疤幚矸椒�，血漿中的雜質(zhì)不干擾樣品的測(cè)定，具有靈敏度高，重現(xiàn)性較好等特點(diǎn)。

 

TSQ Vantage 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（賽默飛世爾科技Thermo Fisher Scientific 公司），配置有電噴霧電離源（ESI）；Dionex Ultimate 3000 RSLC 超高壓液相色譜。

 

標(biāo)準(zhǔn)品：替加環(huán)素和內(nèi)標(biāo)鹽酸四環(huán)素純度均大于98％，信息見(jiàn)表1。用甲醇溶解并配制成1.0 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再根據(jù)需要稀釋成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。其他試劑均為HPLC 色譜純。

 

表1. 待測(cè)化合物信息

 

2.2.1 液相條件：

色譜柱：Hypersil GOLD C18，100mm×2.1mm；

梯度洗脫程序見(jiàn)表2，進(jìn)樣量5μL。

 

表2. 液相色譜梯度條件

 

 

2.2.2 質(zhì)譜條件：

電噴霧電離源（ESI），正離子模式；選擇反應(yīng)監(jiān)控（SRM）掃描模式，噴霧電壓：3000V；氣化器溫度320℃，離子傳輸管溫度：350℃；氮?dú)庾鳛榍蕷夂洼o助氣，其中鞘氣為35arb，輔助氣為10arb，氬氣用作碰撞氣, 碰撞壓力為1.5mTorr；選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM），離子對(duì)信息見(jiàn)表3。

 

表3. SRM 模式中的離子對(duì)信息

 

其中，替加環(huán)素選取m/z 513.2，四環(huán)素選取m/z 410.2 的離子作為定量離子。

 

向0.2mL 血漿中加入10μL 內(nèi)標(biāo)液（100ng/mL 四環(huán)素溶液），加入100μL20% 三氯乙酸（TCA） 沉淀蛋白， 渦旋混合1min，離心10min（13000r/min），取5μL 上清液進(jìn)樣分析。

 

本實(shí)驗(yàn)所用的檢測(cè)條件下，替加環(huán)素在1.98min 左右出峰，內(nèi)標(biāo)四環(huán)素在2.49min 左右出峰，峰形良好，無(wú)雜質(zhì)峰干擾測(cè)定，基線平穩(wěn)（見(jiàn)圖1）。本方法具有較高的特異性，能準(zhǔn)確測(cè)定血漿中替加環(huán)素的濃度，靈敏度較高。

 

 

圖1. 血漿中替加環(huán)素及內(nèi)標(biāo)四環(huán)素的色譜圖

（A-F）：6個(gè)不同來(lái)源的空白血漿的色譜圖；

（G）：空白血漿加入已知濃度替加環(huán)素和四環(huán)素的色譜圖

 

取10μL 替加環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到空白血漿中，配成0.2mL的濃度為100ppt 的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿，按“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作，記錄色譜圖，得到替加環(huán)素血漿基質(zhì)前加標(biāo)的最低檢出限，S/N=6，結(jié)果圖2。

 

 

圖2. 替加環(huán)素LLOD 的色譜圖

 

將1mg/mL 替加環(huán)素溶液逐級(jí)稀釋成一系列濃度，分別取10μL 加入到空白血漿中，配成0.2mL 的濃度分別為5,10,50,100,500,1000,2000ppb 的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿，按“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作，記錄各標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)和內(nèi)標(biāo)的峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，分析物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸計(jì)算，求得直線回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線，平行操作3 次，結(jié)果見(jiàn)表4，圖3。

 

表4. 替加環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)曲線（n=3）

 

 

圖3. 替加環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

 

 

分別取不同量的替加環(huán)素加入到空白血漿中，配成0.2mL的濃度分別為10，100，1600ppb 的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿，按“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作，在批內(nèi)和批間對(duì)每種濃度各做5份樣品，記錄色譜圖，計(jì)算濃度，求得批內(nèi)和批間精密度，結(jié)果見(jiàn)表5。

 

表5. 血漿中替加環(huán)素日內(nèi)和日間精密度（n=5）

 

分別取不同量的替加環(huán)素加入到空白血漿中，配成0.2mL的濃度分別為10，100，1600ppb 的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿，按“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作，在日內(nèi)和日間對(duì)每種濃度各做5 份樣品，記錄色譜圖，計(jì)算濃度，并與加入的標(biāo)準(zhǔn)濃度比較，結(jié)果見(jiàn)表6。

 

表6. 血漿中替加環(huán)素準(zhǔn)確度（n=5）

 

分別取不同量的替加環(huán)素加入到空白血漿中，配成0.2mL的濃度分別為10，100，1600ppb 的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿，按“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作，對(duì)每種濃度各做25 份樣品，5份處理后在自動(dòng)進(jìn)樣器中放置24h；5 份在室溫放置4h 后按“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作，進(jìn)樣分析；5 份于配制好后-20℃冷凍后取出自然解凍，再冷凍再解融（反復(fù)凍融3 個(gè)循環(huán)）后按“血漿樣品處理”項(xiàng)下進(jìn)樣分析；5 份在-80℃冷凍兩周后按“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作，進(jìn)樣分析；5份在-80℃冷凍四周后按“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作，進(jìn)樣分析，結(jié)果見(jiàn)表7。

 

表7. 血漿中替加環(huán)素的穩(wěn)定性（n=5）

 

分別取不同量的替加環(huán)素加入到空白血漿中，配成0.2mL的濃度分別為10，100，1600ppb 的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿，按“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作，記錄樣品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積ƒx(ƒx=As'/Ai）；10，100，1600ppb 樣品直接進(jìn)樣后記錄峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值ƒs(ƒs=As/Ai）, 計(jì)算ƒx 和ƒs 的比值即得到替加環(huán)素的回收率，平行操作5 次，結(jié)果見(jiàn)表8。

 

表8. 血漿中替加環(huán)素的回收率（n=5）

 

本實(shí)驗(yàn)建立了測(cè)定血漿中替加環(huán)素的LC-MS/MS 測(cè)定方法，采用適當(dāng)?shù)臉悠非疤幚矸椒�，血漿中的雜質(zhì)不干擾樣品的測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為5ppb-2000ppb, 線性關(guān)系良好，最低定量限為5ppb；方法學(xué)確證的高、中、低三種濃度的批間和批內(nèi)變異均小于10%；準(zhǔn)確度為95.05%-102.35%；回收率為93.96%-105.63%；血漿中的替加環(huán)素在室溫放置4h、反復(fù)凍融3 次、處理后的樣品在自動(dòng)進(jìn)樣器放置24h 以及在-80℃冰箱冷凍兩周和四周，樣品依然穩(wěn)定，符合生物樣品測(cè)定要求。

 

受試者連續(xù)多次給予藥物替加環(huán)素后，血漿中的替加環(huán)素濃度見(jiàn)表9。

 

表9. 受試者的替加環(huán)素血漿藥物濃度

 

TSQ Vantage 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)檢測(cè)血漿中替加環(huán)素具有靈敏度高、特異性好的優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)限可以做到100ppb；該方法具有寬的線性范圍（5ppb-2000ppb），良好的精密度和準(zhǔn)確度；同時(shí)使用20% 的三氯乙酸沉淀蛋白的方法處理血漿樣品，簡(jiǎn)單快捷，空白基質(zhì)沒(méi)有干擾，回收率可以達(dá)93.96%-105.63%，證明該方法檢測(cè)血漿中的替加環(huán)素具有很好的適用性。