應用Target MS2 方法對大鼠血漿中人重組干擾素進行絕對定量的測試方案

 

顧培明

賽默飛世爾科技（中國）有限公司

 

隨著蛋白質(zhì)組學的不斷發(fā)展，蛋白質(zhì)組學已廣泛深入到生物學研究的各個領域，目前，蛋白質(zhì)組學研究已經(jīng)由傳統(tǒng)的大規(guī)模鑒定逐步轉(zhuǎn)向了靶向蛋白質(zhì)組學，研究內(nèi)容已經(jīng)由蛋白質(zhì)鑒定擴展到了蛋白質(zhì)相對和絕對定量，對復雜樣本中蛋白質(zhì)的相對與絕對定量有助于發(fā)現(xiàn)疾病的生物標志物，對于研究各類疾病的發(fā)生與發(fā)展有著重要的意義。

 

基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學定量方法主要有SILAC，TMT，iTRAQ 以及應用三重四級桿的MRM 等，本文主要介紹了賽默飛世爾新一代臺式高分辨質(zhì)譜儀Q-Exactive 在目標蛋白質(zhì)定量方面的應用。結果顯示Q-Exactive不僅可以在ng級上樣量情況下達到98% 以上的蛋白質(zhì)氨基酸序列匹配度，同時應用target ms2 方法，可以很好的對復雜樣本中目標蛋白質(zhì)進行絕對定量，其定量下限達到了amol，動態(tài)范圍達到了6 個數(shù)量級，且線性相關系數(shù)在0.99 以上。

 

 

 

人重組干擾素α-2b 標準品（濃度為1mg/ml），注射人重組干擾素α-2b 后的處理組大鼠血漿樣本以及空白大鼠血漿樣本。

 

1. 使用Full MS/ddMS2 方法對人重組干擾素α-2b 標準品酶解的肽段進行鑒定，篩選其unique peptide；

2. 將人重組干擾素α-2b 標準品酶解肽段稀釋成不同濃度的標準品，其濃度分別為104ng/ml，103ng/ml，102ng/ml，101ng/ml，100ng/ml，10-2ng/ml，并摻入至空白大鼠血漿樣本酶解肽段中，分別上樣18ul，使用Target MS2 方法根據(jù)其unique peptide 的fragment ion 峰面積，繪制標準曲線；

3. 處理組大鼠血漿酶解肽段上樣18ul， 根據(jù)其unique peptide 的fragment ion 峰面積計算出大鼠血漿中人重組干擾素α-2b 的濃度。

 

高效液相色譜儀：Thermo Scientific Easy-nLC 1000

色譜柱：C18 ,3μm, 100Å ,75μm×15 cm

上樣量：均18 ul

流動相：A：0.1% Formic acid in water； B：0.1% Formic acid

in Acetonitrile

 

色譜梯度：

 

標準品：

質(zhì)譜儀：Thermo Scientific Q Exactive

噴霧電壓：2.6 kV

毛細管溫度：250 ℃

S-lens：50%

碰撞能量：27% HCD

分辨率設置：一級70,000@m/z 200，二級17,500@m/z 200

母離子掃描范圍：m/z 200-1800；子離子掃描范圍：startfrom m/z 100

Data-dependent MS/MS：Top 20

標準曲線與正式樣本：

質(zhì)譜儀：Thermo Scientific Q Exactive

噴霧電壓：2.6 kV

毛細管溫度：250 ℃

S-lens：50%

碰撞能量：27% HCD

分辨率設置：35,000@m/z 200

Isolation Window：4 M/Z

Inclusion List：M/Z 451.75

 

首先使用Q-Exactive 對人重組干擾素α-2b 標準品的酶解肽段進行Full MS/ddMS2 掃描，上樣量為500ng（不計酶解損失），篩選人重組干擾素α-2b 的unique peptide，該肽段必須為人重組干擾素α-2b 所特有的肽段，才可以用于表征人重組干擾素α-2b 的量。

 

下圖展示的為人重組干擾素α-2b 色譜質(zhì)譜的原始圖，圖中可見，整個色譜峰分離比較均一，強度比較高。

 

 

將上述得到的原始文件使用Byonic 軟件進行搜庫處理，觀察蛋白質(zhì)的序列匹配度，數(shù)據(jù)庫使用DrugBank 下載的人重組干擾素α-2b 的氨基酸序列。

 

 

從上述表格可見，人重組干擾素α-2b 的氨基酸序列匹配度達到了98.18%，說明Q-Exactive 的超高靈敏度，在不到500ng 的上樣量的情況下可以對蛋白質(zhì)進行高氨基酸序列匹配度的分析，對于后續(xù)數(shù)據(jù)分析的可靠性非常重要。

下圖展示的是人重組干擾素α-2b 的具體氨基酸序列匹配情況。圖中綠色標記的氨基酸序列為鑒定到的氨基酸，紅色標記的為鑒定到的帶有修飾的氨基酸，黑色標記的為實驗中沒有鑒定到的氨基酸。

 

 

從上述圖中可以看出，165 個氨基酸中只有最后三個氨基酸沒有被鑒定到，分析發(fā)現(xiàn)162 位的氨基酸為R，因而在Trypsin 的酶解中會被切割，產(chǎn)生的肽段為最后三個氨基酸，該肽段過短，不適于質(zhì)譜檢測。

 

從上述的色譜質(zhì)譜原始圖中可以看出在洗脫時間為36.28min，m/z 為451.75 的色譜峰其強度最高， 搜庫

結果顯示該色譜峰為人重組干擾素α-2b 的unique peptide“EDSILAVR”，下圖展示的是EDSILAVR（m/z 451.75）的母離子色譜質(zhì)譜抽提峰及其二級譜圖，

 

 

下圖為上述的肽段EDSILAVR 二級譜圖的解析情況，圖中可見所有的y 系列離子均被鑒定到，子離子的實測m/z 與理論m/z 偏差均在10-3 水平，譜圖質(zhì)量非常高，結果非常可信。另外，從二級譜圖中可以看出，二級碎片子離子y4 ，m/z 458.31，其強度最高，因而在隨后的數(shù)據(jù)分析中選取451.75- 458.31 這一母離子- 子離子對來表征EDSILAVR的含量，進而表征人重組干擾素α-2b 的含量（該方法即為選擇反應監(jiān)測技術：SRM Selected Reaction Monitoring）。

 

 

人重組干擾素α-2b 酶解的標準肽段稀釋成以下幾個濃度：104ng/ml，103ng/ml，102ng/ml，101ng/ml，100ng/ml，10-2ng/ml，各自吸樣8ul， 與10ul 空白血漿酶解的肽段樣本混勻，上樣18ul，質(zhì)譜檢測，檢測方法使用TargetMS2，inclusion list 為m/z 451.75，isolation window 為4 m/z。對子離子458.31 進行抽提，結果見下圖。

 

 

從上圖可以看出，所有6 個濃度的標準品均在36min 左右有一個色譜洗脫峰出現(xiàn)，與上述標準品的洗脫時間一致，該色譜峰為451.75-458.31 母離子- 子離子對的色譜峰，即EDSILAVR 的洗脫峰，分別對各個色譜峰的峰面積（即上圖中色譜峰上顯示的MA 數(shù)值）進行積分，結果見下述表格。

 

 

 

 

從上述結果中可以看出，在6 個數(shù)量級的濃度范圍內(nèi)，濃度與峰面積的線性相關系數(shù)在0.99 以上，說明Q-Exactive的檢測動態(tài)范圍足夠大，可以很好的應用于蛋白質(zhì)藥物代謝動力學研究。

 

 

大鼠血漿樣本上樣18ul，質(zhì)譜檢測，原始結果見下圖，圖中可見在35.33min 有一個明顯的色譜洗脫峰出現(xiàn)，洗脫時間與上述的標準品的洗脫時間相一致，為血漿樣本中的人重組干擾素α-2b 的肽段EDSILAVR 的洗脫峰，對m/z 458.31 這一子離子的面積進行積分。

 

 

峰面積為9787, 代入上述的標準曲線中進行計算，得出原始血漿中人重組干擾素α-2b 濃度為26.9185 ng/ml。

 

綜上所述，Q-Exactive 擁有超高的靈敏度，在不到500ng 上樣量的情況下對人重組干擾素α-2b 的氨基酸序列匹配度達到了98.2%；Q-Exactive 擁有足夠高的動態(tài)范圍，在對人重組干擾素α-2b 的標準品檢測中，其動態(tài)范圍達到了6個數(shù)量級，并且線性相關系數(shù)達到了0.99 以上。簡而言之，Q-Exactive 的超高性能可以很好的應用于大分子藥物代謝的研究中去。