Dominic Roberts,1 Hans Mol,2 Marc Tienstra,2 Cristian Cojocariu,1 and Paul Silcock1

1Thermo Fisher Scientific，Runcorn，UK

2RIKILT – Wageningen UR，Wageningen，The Netherlands

 

準確質(zhì)量；復(fù)雜基質(zhì)；GC Orbitrap 質(zhì)譜；農(nóng)殘分析；QuEChERS；篩查；TraceFinder 軟件

 

全世界都在使用農(nóng)藥來提高作物產(chǎn)量，農(nóng)藥的使用對保證足夠的全球食物供應(yīng)至關(guān)重要。然而，對于消費者以及致力于食品安全保障的政府部門來說，如此廣泛的農(nóng)藥使用及其在最終產(chǎn)品中殘留的可能性，都是心頭之患。

 

因此，法律法規(guī)保障消費者不會接觸到受農(nóng)藥污染的食物。這些法律法規(guī)要求對食物中出現(xiàn)的農(nóng)藥進行種類和數(shù)量的監(jiān)測，并針對具體商品種類給出每種農(nóng)藥允許的最大殘留值（MRL）。由于化合物和商品種類組合的數(shù)量巨大，給實現(xiàn)準確可靠的常規(guī)監(jiān)測帶來很大挑戰(zhàn)。

 

實驗室一直在面對不斷增長的分析壓力，必須以高速度和有競爭力的成本在單次樣本分析中實現(xiàn)廣譜農(nóng)藥篩查。絕大多數(shù)實驗室都會借助氣相色譜或液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀器以及定靶分析的策略。這類方法的確能夠在較大范圍內(nèi)覆蓋需監(jiān)測的化合物種類并達到所需靈敏度和選擇性。然而，它們只局限于目標列表中的化合物，這些化合物通常是根據(jù)殘留量規(guī)定和法律法規(guī)的要求來選擇的，主要是為了證明被檢測的食物樣本適合食用。這些定靶分析技術(shù)通常需要事先仔細地為每種化合物優(yōu)化采集參數(shù)以及采集時間窗口以確保有效檢測。為了擴展分析的視野，近年來使用高分辨全掃質(zhì)譜法的化合物篩查方法開始受到青睞。

 

這些篩查方法使用非定靶的分析策略，先運行一個普通的全掃采集，然后再根據(jù)所用的數(shù)據(jù)庫進行定靶數(shù)據(jù)處理。雖然數(shù)據(jù)分析也是根據(jù)目標化合物列表進行的，不過即便并未在數(shù)據(jù)采集時專門篩查這些未知化合物，仍然可以在數(shù)據(jù)回溯分析中對未知化合物進行分析。

 

為使這一方法適用于常規(guī)分析，數(shù)據(jù)篩查處理軟件必須足夠快足夠準，以便達到歐盟指令描述的要求1，在可接受的低假陰性率水平下實現(xiàn)低濃度農(nóng)殘的檢出。

 

雖然對假陽性率沒有具體要求，不過常規(guī)實驗室還是需要保證這個數(shù)字盡可能的低，以盡量減少進一步分析所需的時間。

 

實驗室檢測的絕大部分樣品都是符合法律法規(guī)要求的，因此能夠快速的區(qū)分開符合要求的樣品和可能受到污染的樣品對實現(xiàn)高效非常重要。在初步的篩查之后，可能的陽性樣品會使用另一套確證方法（例如，GC-MS/MS）進行再分析，以確認是否是陽性結(jié)果，并準確測定農(nóng)殘的濃度。確證分析涉及在合適的基質(zhì)中制備標準曲線等步驟，并不包含在本文描述的篩查方法當中。

 

在本研究中，我們評估了 Thermo ScientificTM Q ExactiveTM GC 組合四極桿-Orbitrap 質(zhì)譜儀（MS） 在準確篩查適合 GC 分析的農(nóng)藥時的表現(xiàn)。Q Exactive GC Orbitrap MS 能夠提供的質(zhì)量分辨率高達 120,000（m/z 200，峰高一半處的全峰寬，F(xiàn)WHM） ，因而能夠?qū)崿F(xiàn)高準確度的質(zhì)量測定，從而有效地在復(fù)雜基質(zhì)中將被分析物與共流出的等質(zhì)量數(shù)干擾物等雜質(zhì)分離開。高掃速和單次目標分析物掃描內(nèi)的高動態(tài)范圍（> 5000）也都有助于從復(fù)雜基質(zhì)中檢出痕量化合物。

 

 

首先用乙酸緩沖液和基于 QuEChERS 方法的提取程序處理食物和飼料樣品。簡短來說，將 10 mL 酸化的（1% 乙酸） 乙腈加入 5 g （早餐麥片或飼料）或 10 g （水果蔬菜等）均質(zhì)化的樣品中。加入混合鹽類，震蕩并離心。向最終提取液（0.5 或 1 g/mL 樣品的乙腈溶液）中加入 55 種農(nóng)藥的混合物，濃度范圍為 0.5–100 ng/g（ppb）。我們分析了多種難度較大的基質(zhì)樣品，包括小麥、韭蔥，以及馬飼料。

 

全部分析均使用 Thermo ScientificTM Q ExactiveTM GC 組合四極桿-Orbitrap 質(zhì)譜儀進行。進樣使用的是 Thermo ScientificTM TriPlusTM RSH 自動進樣器，色譜分離使用 Thermo ScientificTM TRACETM 1310 GC，色譜柱為 Thermo ScientificTM TraceGOLDTM TG-5SilMS 15 m × 0.25 mm I.D. × 0.25 μm 薄膜毛細管柱（P/N： 26096-1301）。

 

更多儀器參數(shù)及細節(jié)參見下表。

 

 

Q Exactive GC 系統(tǒng)在 EI 全掃模式下運行，分辨率為 60,000（FWHM，m/z 200）。此外，還以 15K、30K 和 120K 　等不同分辨率進行了其它實驗。色譜數(shù)據(jù)采集確保不少于每峰 11 個點，以保證峰面積積分的準確性。

 

數(shù)據(jù)采集和處理使用Thermo ScientificTM TraceFinderTM 軟件進行。該軟件整合了儀器控制、方法開發(fā)等功能，以及定性篩查和定量分析等不同的工作流程。

 

本研究的目標是以最高置信度在不同樣品基質(zhì)中大范圍篩查多種農(nóng)藥。分析以篩查樣品中農(nóng)藥殘留是否超過　MRL 　水平（通常為 10 ppb）為目的。評估方式是通過對不同加標濃度的強化小麥（fortified wheat）、馬飼料、以及韭蔥提取液進行篩查，測定所述條件下所加標樣的最低檢出濃度。我們選擇這些基質(zhì)樣品是由于它們在農(nóng)殘分析中以復(fù)雜和具有挑戰(zhàn)性而著稱，圖 1 所示總離子流譜圖也證明了這點。

 

常規(guī)農(nóng)殘分析使用的樣品提取方法非常普通（例如 QuEChERS），得到的提取液非常復(fù)雜多變。由于樣品前處理階段缺乏選擇性，必須在儀器分析過程中進行彌補。提高選擇性的方式可以是使用高質(zhì)量分辨率和高質(zhì)量精度進行分析。隨著樣品復(fù)雜度的增加，質(zhì)譜儀的分辨能力對于可靠的農(nóng)殘檢測十分關(guān)鍵。分辨能力的重要性在適合 LC 的農(nóng)殘分析中已有體現(xiàn)2。此外，高分辨全掃分析無需優(yōu)化數(shù)據(jù)采集參數(shù)即可擴大分析的視野的特性也十分誘人。

 

 

圖 1. 添加了 55 種農(nóng)藥標品的小麥、馬飼料、和韭蔥提取液的全掃總離子流譜圖（TIC），由圖可見樣品的復(fù)雜度。

 

樣品通量是農(nóng)殘分析當中需要考慮的一個重要因素。因此，我們使用了一個快速色譜方法來測試系統(tǒng)在常規(guī)條件下的表現(xiàn)。該色譜方法可以在 17 min 之內(nèi)（兩次進樣之間）完成一次完整的分析，從而能夠在 24 小時之內(nèi)完成 84 次分析。這雖然是一個快速的 GC 方法，質(zhì)譜儀的高掃速仍然確保了每個色譜峰取到了至少 11 個點。圖 2 所示為 峰寬為 1.8 秒的二嗪農(nóng)色譜峰，可見共有 11 個數(shù)據(jù)點。

 

 

圖2. 添加了 10 ng/mL 二嗪農(nóng) （m/z 179.11789 ± 5 ppm 質(zhì)量窗口）的小麥樣品分析的提取離子流圖（XIC），全峰包含 11 次掃描（峰寬 1.8 sec）。數(shù)據(jù)采集在全掃模式下進行，分辨能力為 60,000 FWHM （m/z 200）。如圖所示，每次掃描的質(zhì)量準確度和質(zhì)量差異（ppm）均非常理想，全峰的平均質(zhì)量差異為 0.3 ppm。

 

在以 60,000 質(zhì)量分辨率進行了全掃分析之后，使用 TraceFinder 軟件進行數(shù)據(jù)處理。樣品篩查使用一個包含了 183 種農(nóng)藥的分子式、準確質(zhì)量、保留時間、同位素峰分布（通過診斷離子的分子式推算）、以及碎片離子等信息的數(shù)據(jù)庫進行。雖然以上所有參數(shù)都可以用于鑒定，軟件使用的陽性檢出關(guān)鍵依據(jù)為：主要鑒定離子的提取離子流譜圖中在預(yù)期出峰時間 ± 20 秒窗口內(nèi)必須有色譜峰，并且測得的離子準確質(zhì)量必須在理論值 ± 2 ppm 范圍內(nèi)。同位素峰分布以及碎片離子的保留時間和準確質(zhì)量。引入這些參數(shù)能夠提高分析結(jié)果的可信度并降低假陽性率。

 

好的數(shù)據(jù)處理軟件是成功執(zhí)行常規(guī)篩查的一個關(guān)鍵。TraceFinder 軟件能夠迅速篩查數(shù)據(jù)并檢測是否存在目標農(nóng)藥。我們使用了一個目標化合物數(shù)據(jù)庫來檢測和報告檢出的農(nóng)藥，并注明滿足了哪些檢出標準。圖 3 給出了一個TraceFinder 瀏覽窗口樣例， 圖中顯示的是在添加了 10 ng/mL 標樣的小麥樣品中檢出的一些農(nóng)藥。農(nóng)藥 p,p'-DDT 的檢出和確認是基于保留時間、準確質(zhì)量數(shù)（0.21 ppm）、碎片離子、以及同位素分布信息的吻合，在圖中以紅色標出。數(shù)據(jù)以交通信號燈的形式展示在用戶面前，便于快速審閱。更詳細的信息可以在總結(jié)欄和窗口欄目中查閱，如本樣例中的 XIC 以及 p,p'-DDT 的理論和實際同位素分布情況。即便是在復(fù)雜基質(zhì)中，本系統(tǒng)也能夠提供無與倫比的準確質(zhì)量數(shù)據(jù)，使得化合物檢出的可信度非常高。所有農(nóng)藥篩查都在 < 2 ppm 的質(zhì)量準確度下進行，而如圖 3 所示，實際的質(zhì)量差異通常只有亞 ppm 水平。對主要的診斷離子和碎片離子來說，準確質(zhì)量檢測都能達到這種水平，從而可以自動篩出假陽性結(jié)果或提示用戶快速評估。

 

好的數(shù)據(jù)處理軟件是成功執(zhí)行常規(guī)篩查的一個關(guān)鍵。TraceFinder 軟件能夠迅速篩查數(shù)據(jù)并檢測是否存在目標農(nóng)藥。我們使用了一個目標化合物數(shù)據(jù)庫來檢測和報告檢出的農(nóng)藥，并注明滿足了哪些檢出標準。圖 3 給出了一個 TraceFinder 瀏覽窗口樣例， 圖中顯示的是在添加了 10 ng/mL 標樣的小麥樣品中檢出的一些農(nóng)藥。農(nóng)藥 p,p'-DDT 的檢出和確認是基于保留時間、準確質(zhì)量數(shù)（0.21 ppm）、碎片離子、以及同位素分布信息的吻合，在圖中以紅色標出。數(shù)據(jù)以交通信號燈的形式展示在用戶面前，便于快速審閱。更詳細的信息可以在總結(jié)欄和窗口欄目中查閱，如本樣例中的 XIC 以及 p,p'-DDT 的理論和實際同位素分布情況。即便是在復(fù)雜基質(zhì)中，本系統(tǒng)也能夠提供無與倫比的準確質(zhì)量數(shù)據(jù)，使得化合物檢出的可信度非常高。所有農(nóng)藥篩查都在 < 2 ppm 的質(zhì)量準確度下進行，而如圖 3 所示，實際的質(zhì)量差異通常只有亞 ppm 水平。對主要的診斷離子和碎片離子來說，準確質(zhì)量檢測都能達到這種水平，從而可以自動篩出假陽性結(jié)果或提示用戶快速評估。

 

 

圖 3. 添加了 10 ng/mL 標樣的小麥樣品中檢出的農(nóng)藥 （以 p,p'-DDT 為例）在 TraceFinder 篩查瀏覽器中顯示界面。農(nóng)藥檢出的確認是基于準確質(zhì)量確認（± 2 ppm 質(zhì)量窗口）、保留時間（RT）、同位素峰分布（IP）、和碎片離子（FI）信息的吻合。紅色方框提示的是主要離子和確證離子檢測的亞 ppm 水平質(zhì)量準確度。

 

在本研究中，當加標濃度為 10 ng/mL 時，所有 55 種農(nóng)藥都在小麥、馬飼料、和韭蔥樣品中成功檢出。不僅如此，絕大多數(shù)農(nóng)藥都可以在更低的濃度被檢出。如圖 4 和 5 所示，在小麥基質(zhì)中，53 種農(nóng)藥均可在 < 2.5 ng/mL 濃度水平下檢出，而在加標水平降低至 0.5 ng/mL 時，仍有 47 種農(nóng)藥可被檢出。這種在復(fù)雜基質(zhì)中也可以達到的無可比擬的靈敏度能夠有效支持在 MRL 規(guī)定的濃度水平甚至更低水平實現(xiàn)可信篩查，這也成為 Q Exactive GC 系統(tǒng)的一個獨特特性。

 

圖 4. 小麥中 55 種農(nóng)藥的最低檢出標樣濃度圖。鑒定基于準確質(zhì)量差異 < 2 ppm 和保留時間差異不超過 20 秒。 紅圈為 5 ng/mL 濃度水平。

 

 

圖 5. 馬飼料中 55 種農(nóng)藥的最低檢出標樣濃度圖。鑒定基于準確質(zhì)量差異 < 2 ppm 和保留時間差異不超過 20 秒。 圖中強調(diào)了 5 ng/mL 和 10 ng/mL 濃度水平。

 

只有當分辨能力足以將目標化合物與基質(zhì)干擾和其它目標化合物區(qū)分開來時，使用較低的質(zhì)量準確度容忍度才成為可能。當兩個質(zhì)量輪廓圖重合時，測得的質(zhì)量輪廓實際是兩者之和，導(dǎo)致目標化合物的質(zhì)量測定不準確。圖 6 顯示的正是這一現(xiàn)象。該實驗分別以 15K、30K、60K 和 120K 分辨率對韭蔥樣品進行了分析。 質(zhì)譜圖中可見一個氯苯胺靈的診斷離子，以及一個質(zhì)量相近的背景基質(zhì)離子對其造成干擾。在 60K 和 120K 分辨率下，分析可達到預(yù)期的質(zhì)量準確度，實現(xiàn)基線分離。然而在 15K 和 30K 分辨率時，氯苯胺靈未能與干擾離子實現(xiàn)分離，降低了質(zhì)量準確度。尤其是在 15K 分辨率下，質(zhì)量準確度受到嚴重影響，質(zhì)量差異高達 18.4 ppm。按照本研究使用的篩查標準，即便將質(zhì)量差異容忍度進一步放寬到 10 ppm，仍然會造成氯苯胺靈的假陰性結(jié)果。這些試驗結(jié)果說明高于 60,000 的質(zhì)量分辨能力是必須的，而這個最低分辨能力的具體值則取決于樣品的復(fù)雜度以及目標化合物和干擾物的濃度。

 

 

圖 6. 分辨能力會影響基質(zhì)中被分析物的質(zhì)量準確度。在 15K、30K、60K 和 120K 質(zhì)量分辨率下采集的韭蔥提取液中，10 ng/mL 氯苯胺靈的一個離子的質(zhì)譜圖。15K 和 30K 分辨率不足以分開氯苯胺靈離子與基質(zhì)干擾峰，導(dǎo)致質(zhì)量精確度變差。在 15K 分辨率時，按照本研究的篩查標準，該農(nóng)藥會不能檢出，導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

 

 

圖 7. 在 TraceFinder 軟件中查看韭蔥中丁苯嗎啉的提取離子流譜圖和校準曲線。校準樣品進行了三次平行重復(fù)進樣，線性良好。

 

在常規(guī)分析中，接下來應(yīng)該對樣品中檢出的農(nóng)藥進行定量分析。我們在 0.5–50 ng/mL 濃度范圍內(nèi)，用基質(zhì)匹配過的樣品評估了農(nóng)藥檢測的線性，每個校準標品重復(fù)分析三次。在所有情況下，決定系數(shù)（R2）均 > 0.99，平均值為 R2 = 0.997，回歸殘差 < 25%。

 

 

本次評估的結(jié)果顯示，Thermo Scientific Q Exactive GC 組合四極桿-Orbitrap 質(zhì)譜儀佐以 TraceFinder 軟件，對于食品和飼料的常規(guī)農(nóng)殘篩查來說是一套極其有效的工具。Orbitrap 質(zhì)譜儀的分辨能力、質(zhì)量準確度和靈敏度都非常出色。

 

 *使用高分辨全掃質(zhì)譜分析進行篩查是擴大分析范圍的有效方法，憑借該技術(shù)，無需提前進行采集參數(shù)優(yōu)化即可在單次實驗中分析更多的化合物。

 *快速GC分析和采集速率提高了實驗室的分析效率和樣品通量。超群的質(zhì)量精確度再加上極高的靈敏度，使得可靠的常規(guī)農(nóng)殘篩查成為可能。

 *以 60,000 FWHM （m/z 200）的質(zhì)量分辨率進行數(shù)據(jù)采集能夠消除同質(zhì)量化合物的干擾，提高在復(fù)雜基質(zhì)中篩查農(nóng)藥的結(jié)果可信度。對所有化合物都持續(xù)提供亞 ppm 水平的質(zhì)量精度，確保化合物鑒定結(jié)果可信。

 

1.SANCO/12571/2013. Method validation and quality control procedures for pesticides residue analysis in food and feed.

2. Kellmann, M., Muenster, H., Zomer, P. & Mol, H.(2009) Full Scan MS in Comprehensive Qualitative and Quantitative Residue Analysis in Food and Feed Matrices: How Much Resolving Power is Required?J Am Soc Mass Spectrom, 20, 1464-1476.

3. Thermo Scientific Application Note 10449: Fast screening, identification, and quantification of pesticide residues in baby food using GC Orbitrap MS technology. Runcorn, UK

 

 

 

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