臨床樣本都是寶，別讓它們睡到死�。�！

在與很多醫(yī)生和老師的交流過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)收到這樣的反饋：手上收集了很多臨床樣本，但是沒(méi)有具體方案，不知道怎么利用，樣本越收越多，冰箱越裝越滿，但最終這些樣本一直是在睡大覺(jué)，睡到死！針對(duì)于此，本期向大家推薦吉?jiǎng)P完整的Biomarker篩選方案。進(jìn)一步可開(kāi)發(fā)試劑盒，完成臨床轉(zhuǎn)化，造福于民；退一步可發(fā)表高分文章。

今年7月，國(guó)家科技部發(fā)布了《“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究”重點(diǎn)專項(xiàng)2017年度項(xiàng)目申報(bào)指南建議》，建議指出“……建立多層次精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)知識(shí)庫(kù)體系和生物醫(yī)學(xué)大數(shù)據(jù)共享平臺(tái)，突破新一代生命組學(xué)大數(shù)據(jù)分析和臨床應(yīng)用技術(shù)，建立大規(guī)模疾病預(yù)警、診斷、治療與療效評(píng)價(jià)的生物標(biāo)志物、靶標(biāo)、制劑的實(shí)驗(yàn)和分析技術(shù)體系，形成重大疾病的精準(zhǔn)防診治方案和臨床決策系統(tǒng)，建設(shè)中國(guó)人群典型疾病精準(zhǔn)醫(yī)療臨床方案的示范、應(yīng)用和推廣體系……”。

精準(zhǔn)醫(yī)療的本質(zhì)是通過(guò)基因組、蛋白質(zhì)組等組學(xué)技術(shù)和醫(yī)學(xué)前沿技術(shù)，對(duì)于大樣本人群與特定疾病類型進(jìn)行生物標(biāo)記物的分析與鑒定、驗(yàn)證與應(yīng)用，從而精確尋找到疾病的原因和治療的靶點(diǎn)，并對(duì)一種疾病不同狀態(tài)和過(guò)程進(jìn)行精確分類，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)于疾病和特定患者進(jìn)行個(gè)性化精準(zhǔn)治療的目的，提高疾病診治與預(yù)防的效益。

生物標(biāo)志物（Biomarker）是指可以標(biāo)記系統(tǒng)、器官、組織、細(xì)胞及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)或功能的改變或可能發(fā)生的改變的生化指標(biāo)，具有非常廣泛的用途。不僅可從分子水平探討發(fā)病機(jī)制，而且在準(zhǔn)確、敏感地評(píng)價(jià)早期、低水平的損害方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，可提供早期預(yù)警、預(yù)后療效分析、疾病精準(zhǔn)的分期分型依據(jù)等，在很大程度上為臨床醫(yī)生提供了輔助診斷的依據(jù)。由此不難看出，Biomarker與精準(zhǔn)醫(yī)療的理念不謀而合，在疾病的準(zhǔn)確診斷上有著高度統(tǒng)一。

利用不同組學(xué)技術(shù)通過(guò)高通量篩選尋找不同疾病發(fā)生原因、早診、預(yù)后、分型等不同層面的Biomarker，對(duì)同一種疾病的不同狀態(tài)和過(guò)程進(jìn)行精確分類，從而在此基礎(chǔ)上對(duì)于疾病和特定患者設(shè)計(jì)個(gè)性化精準(zhǔn)治療方案。在這一層面看來(lái)，Biomarker是精準(zhǔn)醫(yī)療的前提，精確的Biomarker對(duì)于后續(xù)針對(duì)不同疾病實(shí)施精準(zhǔn)醫(yī)療有著非常重大的意義，因此，Biomarker早期篩選和后期Panel的建立與驗(yàn)證就顯得尤為重要。

針對(duì)于Biomarker的篩選與驗(yàn)證，吉?jiǎng)P整合多個(gè)平臺(tái)，開(kāi)發(fā)了整體一站式服務(wù)，在提出臨床問(wèn)題的基礎(chǔ)上，提供樣本與臨床資料，即可完成從篩選到驗(yàn)證到試劑盒開(kāi)發(fā)的整套流程。

臨床問(wèn)題提出：臨床問(wèn)題是Biomarker篩選的核心創(chuàng)新點(diǎn)，它可以是疾病的早診預(yù)判、藥物用藥后的療效分析，也可以是疾病分級(jí)判斷或是預(yù)后療效分析等等。但凡是在臨床上可以提出的問(wèn)題，并且可以收取相應(yīng)樣本，都可以作為Biomarker篩選的立足點(diǎn)。

臨床樣本分組積累與臨床數(shù)據(jù)積累：臨床樣本是Biomarker篩選的基礎(chǔ)，因此在提出臨床問(wèn)題的同時(shí)，需要考慮可以收取的樣本量，從前期的篩選到后期的驗(yàn)證都是需要足夠的樣本支持，一般來(lái)說(shuō)年收樣本量最好在百例以上，樣本來(lái)源多種多樣，基本原則是無(wú)創(chuàng)或是微創(chuàng)的樣本優(yōu)先考慮，全血、血清、血漿、尿液、唾液、組織、腦脊液甚至FFPE都作為篩選樣本。對(duì)于分組來(lái)說(shuō)，至少有對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組，比較嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆桨竿�往還會(huì)將實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行細(xì)分以及加入輔助分組。此外臨床信息也十分重要，患者的臨床資料、病理診斷結(jié)果、隨訪記錄……這些臨床信息是后期建立診斷Panel的基礎(chǔ)，可以大大提高Biomarker的可靠性。

高通量篩選和數(shù)據(jù)分析：依據(jù)樣本條件及個(gè)人興趣選取相應(yīng)的高通量篩選方法，從組學(xué)層面考慮，可以是基因組、轉(zhuǎn)錄組或蛋白質(zhì)組，從篩選方法考慮，可以是測(cè)序、芯片、質(zhì)譜等等。通過(guò)高通量手段獲得的數(shù)據(jù)是非常龐大的，這時(shí)就需要擁有強(qiáng)大的生物信息學(xué)團(tuán)隊(duì)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從中挖掘出有價(jià)值的東西（候選Biomarker）。

中低通量技術(shù)擴(kuò)大樣本驗(yàn)證：經(jīng)過(guò)高通量篩選與生信分析，將挖掘出來(lái)的候選Biomarker再回歸臨床進(jìn)行中低通量的擴(kuò)大樣本驗(yàn)證。不同層面的Biomarker可選取不同的方法，SNP/SNV用Sequenom，表達(dá)量、表觀marker、CNV用qPCR，蛋白類可以用ELISA、western及IHC等方法。理論上講驗(yàn)證樣本數(shù)量越多越好，一般至少在百例左右。

新檢測(cè)試劑盒開(kāi)發(fā)： 獲得Biomarker之后結(jié)合生物信息學(xué)分析建立診斷Panel，開(kāi)發(fā)臨床檢測(cè)試劑盒，并進(jìn)行臨床檢測(cè)，驗(yàn)證Panel的有效性。

篇幅受限，下面列舉一個(gè)Biomarker篩選的經(jīng)典案例：Plasma microRNA panel to diagnose hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma。這篇文獻(xiàn)是由復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝癌研究所樊嘉教授領(lǐng)銜課題組在2011年發(fā)表于Journal of Clinical Oncology。文中利用Agilent microRNA芯片篩選、RT-PCR驗(yàn)證等方法在HBV相關(guān)肝癌患者血漿中篩選到了由7個(gè)microRNA組成的早期肝癌診斷分子標(biāo)記物，該檢測(cè)方法對(duì)小于2cm的HBV相關(guān)肝癌診斷準(zhǔn)確率接近90%，效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)檢測(cè)方法。

按照Biomarker篩選整體方案解析一下這篇文獻(xiàn)。第一，提出的臨床問(wèn)題為HBV相關(guān)的肝癌早診，目標(biāo)明確；第二，臨床樣本為微創(chuàng)收集的血漿，良好的Biomarker來(lái)源，且有詳細(xì)的臨床信息，對(duì)于分組來(lái)說(shuō)除了對(duì)照組（正常人）和實(shí)驗(yàn)組（HBV相關(guān)肝癌患者）之外，還加入了輔助分組慢性乙型肝炎和肝硬化，設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)，有效排除可能存在的干擾；第三，利用miRNA芯片篩選到15個(gè)差異miRNA；第四，利用qPCR在407例樣本中進(jìn)行中低通量驗(yàn)證15個(gè)差異miRNA，縮小靶標(biāo)miRNA范圍至7個(gè)；第五，結(jié)合臨床數(shù)據(jù)，重新進(jìn)行生物信息學(xué)分析，建立Panel，再于390例樣本中驗(yàn)證Panel的有效性，發(fā)現(xiàn)使用該panel對(duì)HBV相關(guān)肝癌早診有效率高達(dá)94.1%，此外，區(qū)分區(qū)分肝癌與慢性乙型肝炎的準(zhǔn)確率達(dá)84.2%，區(qū)分肝癌與肝硬化的準(zhǔn)確率達(dá)88.4%。

Biomarker作為最直接快速有效的診斷手段，其篩選與獲得可在疾病診斷、發(fā)展、治療、以及療效監(jiān)測(cè)等多個(gè)方面發(fā)揮重要的作用。近年來(lái)尋找和發(fā)現(xiàn)有價(jià)值的Biomarker已經(jīng)成為目前研究的一個(gè)重要熱點(diǎn)。精準(zhǔn)醫(yī)療是醫(yī)學(xué)的未來(lái)發(fā)展方向，包括精準(zhǔn)預(yù)防，診斷，治療和預(yù)后四個(gè)層面。精準(zhǔn)醫(yī)療發(fā)展關(guān)鍵在于Biomarker的發(fā)現(xiàn)與臨床實(shí)踐。

各位手頭有臨床樣本的老師，趕快行動(dòng)起來(lái)，別再讓您的樣本睡大覺(jué)。