動(dòng)物總RNA的提取與電泳

I．  實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求
A.   理解和掌握提取和純化動(dòng)物總RNA的技術(shù)原理和操作方法。
B.   理解和掌握通過電泳鑒定提取所得的動(dòng)物總RNA的技術(shù)原理和操作方法。
 
II． 實(shí)驗(yàn)原理和背景知識(shí)
A.   RNA是生命活動(dòng)中基因表達(dá)過程非常重要的生物大分子，如mRNA,它攜帶了DNA的全部編碼信息。RNA的分離是研究基因功能的重要基礎(chǔ)之一，在分子生物學(xué)中占有重要的地位。提取的mRNA可用于Northern blot、RT-PCR、構(gòu)建 cDNA文庫、Gene Chips以及體外翻譯等實(shí)驗(yàn)。
B.   本次試驗(yàn)中，由于RNase極穩(wěn)定，所以，在操作RNA時(shí)，要格外仔細(xì)，以防RNA被降解。在提取RNA之前，必須對(duì)所用器皿進(jìn)行RNase滅活處理。如用180oC干烤8小時(shí)以上處理玻璃器皿，或用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡玻璃器皿和其它用品。所用水以及相關(guān)的緩沖液也需要用0.1% DEPC水處理，但Tris-Cl緩沖液等不可以用DEPC處理。（注意：DEPC有致癌之嫌 ，必須小心操作，防止接觸與吸入 �。�
C.   在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，所含RNA主要是 rRNA（占80～85％）、tRNA及小分子RNA（占10～15％）和mRNA（占1～5％）。rRNA含量最豐富，由28S、18S和5S幾類組成。mRNA種類繁多，分子量從數(shù)百至數(shù)千堿基不等，但絕大多數(shù)mRNA在3’端都有一個(gè)Poly-A尾巴，因此，可根據(jù)此特性用寡聚脫氧胸苷(Oligo dT)層析柱從總RNA中將 mRNA分離出來。一般情況下，提取的總RNA也可用于Northern blot試驗(yàn)。
D.   提取動(dòng)物RNA的實(shí)驗(yàn)操作中要注意的問題有以下幾點(diǎn)：
1.一般用機(jī)械研磨或勻漿的方法破碎動(dòng)物組織細(xì)胞；
2.要加入蛋白質(zhì)變性劑，使核蛋白與RNA分離并釋放出RNA；
3.抑制內(nèi)源和外源RNase活性；
4.將RNA與DNA、蛋白質(zhì)及其它細(xì)胞成分分開。
E.   總體而言，目前在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用較多，較為成熟的提取總RNA的方法有3種:
1.    苯酚法：用SDS變性蛋白并抑制RNase活性，經(jīng)多次酚/氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用NaAC和乙醇沉淀RNA；
2.    胍鹽法：用異硫氰酸胍或鹽酸胍和b-巰基乙醇變性蛋白，并抑制RNase的活性，經(jīng)氯仿抽提后再沉淀；
3.    氯化鋰沉淀法：因?yàn)殇囋谠谝欢╬H下能使RNA相對(duì)特異地沉淀，但容易使小分子RNA損失，而且殘留的鋰離子對(duì)mRNA有抑制作用。
F.   在本次實(shí)驗(yàn)中，RNA提取過程采用的是Invitrogen公司的TRIzol試劑，其原理是依據(jù)胍鹽法。即在含有強(qiáng)的異硫氰酸胍變性劑的提取液中裂解動(dòng)物組織粉末，在提取緩沖液中含有RNase抑制劑，抑制RNase活性，保證RNA的完整性。樣品在TRIzol 試劑中能夠充分被裂解，在加入氯仿離心后，溶液會(huì)形成上清層、中間層和有機(jī)層（下層），RNA分布在上清層中，收集上清層后，經(jīng)異丙醇沉淀便可以回收得到總RNA。
G.    所提取動(dòng)物總RNA的電泳和檢測(cè)：
RNA的檢測(cè)主要用瓊脂糖凝膠電泳，分為非變性電泳和變性電泳。一般變性電泳用的最多是甲醛變性電泳（如Northern blot 實(shí)驗(yàn)過程中）。
由于RNA分子是單鏈核酸分子，它不同于DNA的雙鏈分子結(jié)構(gòu)，其自身可以回折形成發(fā)卡式二級(jí)結(jié)構(gòu)及更復(fù)雜的分子狀態(tài)，以至通過一般傳統(tǒng)的瓊脂塘凝膠電泳難以得到依賴于分子量的電泳分離條帶，為此電泳上樣前將樣品于65攝氏度加熱變性5分鐘，使RNA分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)充分打開，并且在瓊脂糖凝膠中加入適量的甲醛，可保證RNA分子在電泳過程中持續(xù)保持單鏈狀態(tài)，因此，總RAN樣品便在統(tǒng)一構(gòu)像下得到了瓊脂糖凝膠上的依賴于分子量的逐級(jí)分離條帶。而且RNA變性后有利于在轉(zhuǎn)印過程中與硝酸纖維素膜的結(jié)合。RNA通過甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，可以直觀快捷的分析RNA質(zhì)量之優(yōu)劣，當(dāng)有標(biāo)準(zhǔn)的“分子標(biāo)尺”（marker）存在時(shí)，還可相對(duì)客觀的對(duì)總RNA樣品進(jìn)行定性和定量。為測(cè)定片段大小，可在同一塊膠上加標(biāo)記物一同電泳，之后將凝膠切下，上色、拍照。

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