腺相關(guān)病毒（AAV）作為一種安全、持久、高效、高特異性的基因操作工具，在生物學(xué)特別是神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域中被廣泛使用。許多新手對(duì)于AAV的使用往往是知其然而不知其所以然。這篇短文將以圖文結(jié)合的形式爭(zhēng)取讓大家在最短的時(shí)間內(nèi)全面了解這種病毒工具。

什么是AAV？

野生型AAV是一種復(fù)制缺陷型微小病毒，需要腺病毒或皰疹病毒幫助其在體內(nèi)復(fù)制擴(kuò)增。而我們做實(shí)驗(yàn)用的是不需要輔助病毒的重組AAV病毒（rAAV）。將目的基因的CDS區(qū)序列或者RNAi干擾序列插入rAAV表達(dá)質(zhì)粒中，包裝病毒，然后直接使用rAAV感染細(xì)胞就能完成目的基因操作。

什么時(shí)候用rAAV？

當(dāng)我們需要對(duì)特定基因進(jìn)行過表達(dá)或干擾時(shí)，特別是做動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，就可以使用rAAV病毒。針對(duì)不同的實(shí)驗(yàn)需求，下表可以幫助您選擇合適的病毒工具。

rAAV的優(yōu)點(diǎn)是什么？

1.安全性高，目前還沒有發(fā)現(xiàn)AAV對(duì)人體致�。幻�10個(gè)人中就有8個(gè)人在一生中會(huì)感染AAV，而rAAV更是去除了96%的AAV基因組，進(jìn)一步確保了安全性。目前唯一通過歐盟藥監(jiān)局的基因治療藥物Glybera也是一種rAAV。

2.免疫原性低：當(dāng)AAV用局部大劑量感染肌肉、腦、眼等組織時(shí)，很少有感染上的細(xì)胞之后被免疫系統(tǒng)所清除。這種特性對(duì)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上顯然極有幫助。

3.感染譜廣：幾乎所有處于分裂期和靜止期的細(xì)胞都可以使用AAV來感染。

4.表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)：rAAV可在宿主細(xì)胞中形成附加體（episome）存在于細(xì)胞核中，在細(xì)胞分裂不旺盛的組織中可持續(xù)表達(dá)5個(gè)月以上。

5.擴(kuò)散性強(qiáng)：rAAV具有遠(yuǎn)高于腺病毒和慢病毒的擴(kuò)散性，可以穿透血腦屏障，是最理想的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞感染工具。

6.高穩(wěn)定性：rAAV病毒可使用冰袋運(yùn)輸，并且對(duì)氯仿等試劑具有抗性

7.特異性強(qiáng)：rAAV有十?dāng)?shù)種常用的血清型，不同的血清型對(duì)不同的臟器有較高的識(shí)別及感染能力。

rAAV的局限性有哪些？

1.體外實(shí)驗(yàn)表達(dá)水平較低：主要是因?yàn)閞AAV病毒的基因組是單鏈DNA，在體外環(huán)境形成雙鏈并轉(zhuǎn)錄翻譯外源基因的效率非常低。可以在體外水平感染rAAV病毒的同時(shí)感染輔助病毒比如Ad5型腺病毒或者終濃度10~50mM的丁酸鈉等方法提高細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的rAAV表達(dá)量。

2.需較長(zhǎng)時(shí)間開始表達(dá)：同樣是需要從單鏈DNA變成雙鏈DNA，rAAV在感染后需要較長(zhǎng)的時(shí)間來表達(dá)外源基因，所以rAAV感染后建議至少1周后做切片觀察。

怎么選擇合適的rAAV血清型？

目前文獻(xiàn)中使用最多的rAAV血清型包括2,5,8,9。這幾種血清型基本涵蓋了所有組織和臟器的特異性感染，吉?jiǎng)P基因也可以提供這些常用血清型的rAAV改造和包裝服務(wù)。下圖是常用血清型所對(duì)應(yīng)的組織臟器總結(jié)：

怎樣實(shí)現(xiàn)器官/細(xì)胞特異的表達(dá)？

很多時(shí)候我們需要在特定的器官/細(xì)胞中表達(dá)外源序列而不影響其他臟器，這時(shí)我們有以下幾種策略：

1.局部注射，顧名思義就是直接在想表達(dá)的地方注射rAAV就可以了，適合器官水平特異感染，容易操作。

2.使用組織/器官特異啟動(dòng)子來表達(dá)外源基因包裝rAAV，此類rAAV即使感染了其他組織也由于特異性啟動(dòng)子而不會(huì)在其他組織中表達(dá)。

3.Cre-on，F(xiàn)lex，DIO，double floxed這些技術(shù)名稱經(jīng)常在文獻(xiàn)中被提及，其實(shí)都是一回事，就是使用Cre-Loxp系統(tǒng)，經(jīng)過兩次染色體重組在特定臟器中表達(dá)外源基因。前提是我們需要獲得特定的Cre小鼠后才可以使用這個(gè)技術(shù)。Cre-on系統(tǒng)的技術(shù)原理如下：

吉?jiǎng)P基因可以提供適合各種器官/細(xì)胞特異表達(dá)的rAAV工具滿足實(shí)驗(yàn)需求。

體內(nèi)使用rAAV的操作注意點(diǎn)有哪些？

1.小鼠的操作通過尾靜脈注射的rAAV量推薦在10E11~12v.g數(shù)量級(jí)，體積推薦在100~200ul；針對(duì)腦部的感染建議用量參考下表：

2. 在實(shí)驗(yàn)過程中稀釋病毒產(chǎn)品的等滲溶液沒有其他特殊要求，常規(guī)的動(dòng)物試驗(yàn)用等滲溶液即可，如PBS、生理鹽水等。

體外使用rAAV的操作注意點(diǎn)有哪些？

1.胰酶會(huì)破壞細(xì)胞表面的rAAV病毒受體，因此需要在胰酶消化12h后再進(jìn)行rAAV感染操作。

2.如感覺rAAV感染效果不佳，可嘗試去除血清。

3.rAAV與細(xì)胞的吸附過程非常迅速，需要實(shí)現(xiàn)混勻后再處理細(xì)胞，不然會(huì)出現(xiàn)局部未被感染的情況。

4.rAAV感染不需要添加慢病毒助感染試劑諸如polybrene等。

用完后怎么處理？

對(duì)AAV最有效的消毒劑是新鮮配制的1%次氯酸鈉溶液：

1. 配制時(shí)，將84消毒液原液加水稀釋

2. 浸泡15 min以達(dá)到消毒目的

3. 可以用它處理可回收的物品如玻璃器皿或是污染廢液（終濃度是1%），但如果是不銹鋼器物切不可直接擦拭，否則會(huì)引起表面腐蝕。

其他的處理方式包括用2%戊二醛溶液或是0.25% SDS溶液，還可以121℃高溫消毒1小時(shí)。

本文列舉了一些常見的rAAV問題，如有在具體實(shí)驗(yàn)中遇到其他問題也歡迎聯(lián)系當(dāng)?shù)丶獎(jiǎng)P基因業(yè)務(wù)員或撥打全國(guó)免費(fèi)技術(shù)支持熱線800-720-0302咨詢。