銳賽小課堂技術(shù)篇0702-113 
摘要:

腺相關(guān)病毒(AAV)是一種人細(xì)小病毒， 因?yàn)槟茏鳛橐环N基因治療載體而受到廣泛關(guān)注。目前大多數(shù)生成rAAV的實(shí)驗(yàn)方案需要共轉(zhuǎn)染一個載體質(zhì)粒和一個表達(dá)病毒復(fù)制和結(jié)構(gòu)基因的包裝質(zhì)粒到腺病毒(Ad)感染的培養(yǎng)細(xì)胞中。但是也可以通過新的輔助質(zhì)粒(pH3和pH5)，排除了Ad共轉(zhuǎn)染的需求。輔助質(zhì)粒表達(dá)AAV的rep和cap基因和Ad E2A、VAI和E4基因。當(dāng)輔助質(zhì)粒在沒有Ad感染的情況下共轉(zhuǎn)染到人293細(xì)胞中，rAAV載體產(chǎn)量超過了pAAV/Ad包裝質(zhì)粒的80倍。另外，有復(fù)制能力的AAV在rAAV制備過程中少于0.00125%。該雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)因其簡便性和高產(chǎn)出而使AAV載體系統(tǒng)能被更廣泛地使用。

1．簡介
腺相關(guān)病毒(AAV)是一個常見的人細(xì)小病毒，自然缺陷、無包被和無致病原性。AAV復(fù)制周期由兩個明顯的階段構(gòu)成：潛伏期和增殖期。在缺少輔助病毒諸如腺病毒(Berns,1990;Muzyczka,1992;Berns和Giraud,1996)、皰疹病毒、牛痘病毒或者在基因毒條件下(Yakobson等,1989),AAV能復(fù)制產(chǎn)生子代病毒顆粒。在缺少輔助病毒的情況下，腺相關(guān)病毒整合其基因組到19號染色體的一個特別位點(diǎn)并保持整合直到隨后的輔助病毒將其從潛伏狀態(tài)下拯救出來(Kotin等，1990)。AAV的位點(diǎn)特異性的整合能力、其自然缺陷以及其無致病原性使其成為基因治療載體成為可能。AAV基因組是一個線性、單鏈(ssDNA)分子，4680個核苷酸，在每個末端含有一個145個堿基末端重復(fù)序列(TR)（Srivastava等,1983）。TR序列折疊成發(fā)卡結(jié)構(gòu)作為DNA復(fù)制起始和包裝重組AAV基因組為感染性的病毒顆粒所需的唯一已知順式作用元件。
重組腺病毒載體(rAAV)的構(gòu)建通常涉及rep和cap基因的剔除和將感興趣的轉(zhuǎn)基因插入TR元件之間。關(guān)鍵的Ad輔助基因包括：E1a轉(zhuǎn)錄激活A(yù)d以及AAV基因，E1b和E4編碼增進(jìn)mRNA裝運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)的蛋白質(zhì)，E2a表達(dá)一個ssDNA結(jié)合蛋白質(zhì)促進(jìn)AAV DNA復(fù)制，VAI RNA基因生成一個小RNA轉(zhuǎn)錄物增進(jìn)AAV capsid mRNA的翻譯。
此繁瑣過程的局限性阻止了rAAV廣泛發(fā)展為基因治療的載體。如上所述載體的生成總是導(dǎo)致載體的明顯Ad污染，因此需要熱處理和嚴(yán)格的純化方法滅活和去除Ad病毒顆粒污染。盡管載體和包裝質(zhì)粒之間通常沒有同源序列，但是經(jīng)常產(chǎn)生野生型樣有復(fù)制能力的AAV(rcAAV)(Allen等，1997；Wang等，1998)。已經(jīng)進(jìn)行了許多嘗試改進(jìn)rAAV載體的包裝效率。它們包括：發(fā)展表達(dá)一些或所有包裝所需的AAV基因的細(xì)胞系（Yang等,1994;Clark等,1995;Tamayose等,1996;Inoue和Russell,198），構(gòu)建Ad輔助質(zhì)粒能夠用來替代Ad感染(Matsu***a等,1998;Xiao等，1998b)和發(fā)展重組Ad攜帶rAAV載體基因組(Gao等,1998)。
我們已經(jīng)構(gòu)建了新的輔助質(zhì)粒，完全不用在rAAV包裝過程中感染Ad。這些質(zhì)粒含有Ad基因組的VA、E2a和E4基因以及AAV的rep和cap基因。當(dāng)轉(zhuǎn)染到含有Ad5E1a和E1b基因的人293細(xì)胞中，輔助質(zhì)粒提供了一個有效的、無Ad污染的包裝系統(tǒng)。我們用此新系統(tǒng)所產(chǎn)生的rAAV滴度與大多pAAV/Ad包裝質(zhì)粒(Samulski等,1989)相比提高了80倍。另外，Ad再也不能產(chǎn)生，有復(fù)制能力的AAV在任何載體制備過程中尚未發(fā)現(xiàn)。

2.材料和方法
2.1. 質(zhì)粒、細(xì)胞和病毒
一個rAAV載體質(zhì)粒，表達(dá)人綠色熒光蛋白的pTR-UF5(Peel等,1997)被用到所有包裝實(shí)驗(yàn)中來優(yōu)化該系統(tǒng)。這個pAVbgal載體質(zhì)粒含有AAV TR，位于巨細(xì)胞病毒(CMV)早期轉(zhuǎn)錄啟動子和E.coli b半乳糖苷酶基因的兩側(cè)。PAAV/Ad質(zhì)粒被用來作為一個包裝質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒進(jìn)行比較(Samulski等，1989)。pCDMrep質(zhì)粒含有AAVrep基因，受CMV早期啟動子的調(diào)控(Yang和Trempe，1993)。
19193bp的輔助質(zhì)粒，pSH3和pSH5可以通過幾個步驟來構(gòu)建。一個1.5kb含有VAI和VAII基因的HindIII到SalI的片段(來自Ad5的nt9831-11555)被插入到pGEM3Z的同一位點(diǎn)產(chǎn)生pVA3。將一個5.8kb含有E2a基因的BamHI和EcoRI的片段(來自Ad的nt21563-27331)插入到pVA3的同樣位點(diǎn)中產(chǎn)生pVA3E2a。來自pSub201的4.3kb XbaI片段(AAV2中的nt177-4471)，包含AAV rep和cap基因，隨后被插入到pVAE2aE4的兩個XbaI位點(diǎn)。其中一個pVAE2aE4上的XbaI位點(diǎn)位于E2a和VAI和II基因片段，另外一個位點(diǎn)(在Ad2基因組的nt10580)在VAI基因的上游被發(fā)現(xiàn)。兩個版本的輔助質(zhì)粒(pSH3和pSH5)區(qū)別在于4.3kb XbaI插入片段的方向，并在Fig.1B顯示。 pSH3和pSH5輔助質(zhì)粒保存在E.coli的HB101株中。質(zhì)粒從500ml的細(xì)菌培養(yǎng)物中純化出來，其分為4´125m，每個部分用Qiagen Plasmid Maxi試劑盒的方法處理。 人293(Ad-5轉(zhuǎn)化胎腎上皮)細(xì)胞和Hela細(xì)胞在補(bǔ)充有10%胎牛血清和抗體的EMEM中培養(yǎng)。細(xì)胞在37°C、5％CO2的單層培養(yǎng)基中培養(yǎng)。對照的包裝實(shí)驗(yàn)感染倍數(shù)(m.o.i)為15的Ad5型在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)1h，隨即進(jìn)行轉(zhuǎn)染。Ad通過在Hela細(xì)胞上的噬斑形成滴定。 Fig.1. rAAV包裝所用的質(zhì)粒(A)pTR-UF5含有CMV啟動子(箭頭)所驅(qū)動的人gfp基因和HSV－tk啟動子(箭頭)所驅(qū)動的neoR基因。整個構(gòu)建的兩側(cè)有AAV TR元件(填充的方塊)。pAVbgal含有E.coli b-半乳糖苷酶基因，受CMV啟動子(箭頭)所控制。轉(zhuǎn)錄盒兩側(cè)是AAV TR元件（填充的方塊）。pAAV/Ad含有AAV rep 和cap基因，兩側(cè)是Ad末端重復(fù)元件（空方塊）（B）pSH3和pSH5含有Ad E4,E2a和VA RNA基因。兩個質(zhì)粒也含有AAV rep和cap基因。圖下的數(shù)字指的是Ad和AAV基因組中的核苷酸數(shù)目。pSH3和pSH5的區(qū)別是在AAV DNA序列中的方向。為了清楚，質(zhì)粒圖譜的其余部分未列。

2.2. rAAV載體產(chǎn)生和滴定 對于小規(guī)模的包裝實(shí)驗(yàn)，8´105 293細(xì)胞在35mm6孔盤上種植。24小時后，根據(jù)生產(chǎn)商的方法用lipofectamin（Life Technologies）一式三份轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物。對于開始的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，所用的載體對輔助質(zhì)粒的比例在表1列出。根據(jù)載體和輔助質(zhì)粒的大小，1mg:3mg比例相應(yīng)于1:1的pTR-UF5對pSH3/5的摩爾比。pAAV/Ad質(zhì)粒與Ad共感染，3或5mg的pAAV/Ad與1mg的pTR-UF5共感染。pGEM3Z質(zhì)粒(Promega)被共轉(zhuǎn)染后保持不同轉(zhuǎn)染的相同總DNA濃度。對于伴隨Ad感染的轉(zhuǎn)染，在加入DNA到細(xì)胞前病毒被吸附到無血清培養(yǎng)基中細(xì)胞單層上1h。轉(zhuǎn)染后72小時，細(xì)胞被刮到2ml培養(yǎng)基中收獲起來。細(xì)胞隨后用1ml無菌PBS清洗。PBS清洗液加到細(xì)胞懸浮物中，凍融5次后超聲破碎(3,36mm 45s)。提取物在4000´g離心10分鐘去除細(xì)胞碎片，裂解液上清含有重組載體vAVgfp，它將被用到隨后的轉(zhuǎn)導(dǎo)中。在轉(zhuǎn)導(dǎo)之前，這些轉(zhuǎn)染的Ad用 56°C熱處理30分鐘。 對于大規(guī)模載體包裝，20´1 125px的培養(yǎng)盤，每個含有5´106 293細(xì)胞，以及用鈣磷酸鹽沉淀方法(Wigler等,1979)轉(zhuǎn)染了10mg pAVgal和50mg pSH3。72小時后，收獲培養(yǎng)物，低速離心沉淀細(xì)胞，沉淀凍融4次，如前所述超聲破碎。CsCl2加到裂解物中，終濃度為1.41g/ml，用折射指數(shù)確定。懸浮物在SW41轉(zhuǎn)頭上40 000rpm離心48小時。將含有可見載體的條帶從梯度中去除，其密度可通過測量折射指數(shù)來確定。CsCl2離心步驟重復(fù)，獲得的載體制備后進(jìn)行透析，更換4次PBS，保存在－80°C。產(chǎn)生的載體vAVgal按下述方法滴定。 為了確定rAAV的滴度，4´104Hela細(xì)胞被種植到24孔培養(yǎng)盤中，感染m.o.i為10的Ad，用系列稀釋的轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。2、3天后，在廣泛細(xì)胞病理效應(yīng)被發(fā)現(xiàn)之前用帶有EPI-熒光設(shè)備的DIAPHOT-***理光倒置顯微鏡在20倍下觀察。計(jì)數(shù)產(chǎn)生良好分離的熒光細(xì)胞載體的稀釋倍數(shù)。因而，每個陽性細(xì)胞代表了一個載體轉(zhuǎn)導(dǎo)單位（T.U.）。為了確定rAAVgal載體的滴度，純化載體的稀釋液被用來感染細(xì)胞。細(xì)胞用PBS溶解的95％甲醇固定，用X-gal顯色。每個藍(lán)染的細(xì)胞代表一個載體轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(T.U.)。 載體基因組拷貝數(shù)用點(diǎn)印跡雜交分析來確定，如前所述方法測定A260(Fisher et al.,1996)。對于6孔盤的小規(guī)模包裝實(shí)驗(yàn)，制備的原始載體用DNase I在37°C處理30分鐘。DNase 在75°C滅活，蛋白質(zhì)用50mM Tris 1mM EDTA 0.1%SDS 0.5mg/ml蛋白酶K在37°C消化12小時。對于CsCl2純化的載體，使用相同的步驟，但不用DNase步驟。載體DNA煮沸5分鐘，用Bio-Dot裝置(Bio-Rad)加到硝酸纖維素膜上（Schleicher和Schuell）。每個孔用0.5M乙酸胺300ml(pH5.2)洗滌。洗滌印跡按照2.4部分 Southern blot方法處理，載體特異的探針標(biāo)記，暴露于Kodak X-omat X線膠片(Eastman Kodak)。比較載體雜交信號與已知稀釋濃度印跡到同樣濾膜上的質(zhì)粒DNA，精確估計(jì)基因組拷貝數(shù)。用Ambis Image Acquisition and Analysis系統(tǒng)定量雜交濾膜上的放射性和X-線膠片上的光密度。

2.3 蛋白質(zhì)分析 為了分析AAV Rep和Cap蛋白質(zhì)表達(dá)，按照2.2部分所述進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48小時，將培養(yǎng)物刮到冷PBS/Mg(PBS含有5mM MgCl2)，細(xì)胞低速離心沉淀收獲。細(xì)胞沉淀在冰上用200ml STM-NP緩沖液(25mM蔗糖,10mM Tris-HCl，pH8.0,10mM MgCl2,0.5%NP-40,1.0mM PMSF, 0.1Mm DTT)中裂解。裂解物2000´g離心5分鐘獲得核沉淀。核沉淀在200ml IPP緩沖液中重懸，冰浴45分鐘并經(jīng)常渦旋。核抽提物在14 000´g離心去除DNA和核碎片。上清液與SDS-PAGE樣品緩沖液混合，100°C加熱5分鐘，14mA 10%SDS-PAGE凝膠分離過夜。用一個Trans-Blet SD 半干轉(zhuǎn)移槽(Bi－Rad)轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到硝酸纖維素膜上。濾膜在PBS溶解的2％奶粉阻斷1-2h，隨后用兔抗Rep（Trempe等，1987）或倉鼠抗Cap（American Type Culture Collection）一抗(含有1%奶粉的PBS稀釋200倍)室溫孵育2小時或4°C過夜。印跡用含有0.05% Tween-20的PBS洗滌3次，每次10分鐘。合適的堿性磷酸酶綴合的二抗用含有1％奶粉的PBS稀釋2000倍，室溫下孵育孵育印跡1小時。用PBS-Tween-20緩沖液洗滌3次，印跡用溶解在二甲基甲酰胺的NBT和BCIP染色5－20分鐘。
2.4 DNA分析 為了分析病毒DNA，包裝轉(zhuǎn)染按照2.2部分所述進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后48小時，將培養(yǎng)物刮到冷PBS/Mg，低速離心收獲。染色體外DNA用Hirt的方法(Hirt,1967)從細(xì)胞外分離。簡單地說細(xì)胞沉淀在200ml裂解液(10mM Tris,pH8.0,1.0mM EDTA, 1.0%SDS)中重懸，加熱40mg蛋白質(zhì)酶K。37°C消化2個小時后，加入50ml 50M NaCl,冰浴4h。溶液在4°C 14000´g離心30分鐘去除染色體沉淀。上清液用5ml RNase混合液(Ambion, 5mg RNase A,100單位RNaseT1)37°C處理2小時，用酚/氯仿(1:1)抽提1次，再用氯仿抽提1次。DNA用2倍體積的乙醇沉淀，用DpnI處理去除輸入的質(zhì)粒DNA。DNA在瓊脂糖凝膠 上分離，按上述方法轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上(Hirt,1967)，用Stratalinker (Stratagene)將其UV交粘到濾膜上。濾膜用gfp基因特異的32P探針 或者AAV特異的探針雜交。如前所述進(jìn)行雜交和洗滌。用隨機(jī)標(biāo)記試劑盒制備雜交探針。膜暴露于X線膠片。 為了估計(jì)rcAAV的量，1´106 293細(xì)胞感染了Ad（m.o.i）和CsCl2純化的野生型AAV或vAVgal的稀釋液。用pAAV/Ad或pSH3/5作為輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染制備的vAVgfp原液被用來轉(zhuǎn)導(dǎo)Ad感染的細(xì)胞。48小時后，培養(yǎng)物被收獲，病毒DNA被制備并通過瓊脂糖凝膠電泳和Southern 雜交分析。

3.結(jié)果
3.1 用AAV/Ad輔助質(zhì)粒的rAAV包裝 制備重組AAV載體的最常用的實(shí)驗(yàn)方案包括用含有目的基因、病毒TR元件的AAV為基礎(chǔ)的載體質(zhì)粒和提供Rep和Cap蛋白質(zhì)的輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Ad感染的組織培養(yǎng)細(xì)胞。一個最常用的輔助質(zhì)粒是pAAV/Ad(Samulski 等,1989)。這個方法的主要缺點(diǎn)是在載體原液中污染Ad、生成能夠復(fù)制的AAV，而且整個過程的低效率。為了克服這些問題，我們構(gòu)建了一個新型的含有AAV rep和cap基因以及Ad E2a,E4和VA的輔助質(zhì)粒。當(dāng)質(zhì)粒與高度易轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞系聯(lián)合使用(Graham等,1977)時，它含有Ad E1a和E1b基因，所有包裝rAAV載體所需要的成分都存在。為了測試這些質(zhì)粒是否能夠包裝一個AAV為基礎(chǔ)的載體，我們用表達(dá)綠色熒光蛋白的pTR-UF5（Peel等，1997）質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中(Fig1A)，用的是lipofectamine的方法。為了確定兩個質(zhì)粒的最佳比例我們使用了幾個不同比例。作為對照，我們同樣使用了Ad-5(15m.o.i)感染293細(xì)胞，然后用載體質(zhì)粒和pAAV/Ad作為輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染它們。72小時后，按2.2部分的方法收獲細(xì)胞、裂解準(zhǔn)備轉(zhuǎn)導(dǎo)。裂解液一式三份被用來轉(zhuǎn)導(dǎo)Ad感染的Hela細(xì)胞。綠色熒光細(xì)胞3天后用熒光顯微鏡計(jì)數(shù)。幾個實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在Table1.列出。很明顯在這些包裝效率與pAAV/Ad輔助質(zhì)粒相比較的實(shí)驗(yàn)中，我們用pSH3和pSH5質(zhì)粒獲得了更多的rAAV。我們用輔助質(zhì)粒常規(guī)地比pAAV/Ad和Ad感染獲得更多的rAAV。每個細(xì)胞的最高產(chǎn)出135T.U.比pAAV/Ad對照所獲得的高80倍。在其它載體質(zhì)粒比輔助質(zhì)粒更多的比例沒有產(chǎn)生大量的rAAV。隨后用點(diǎn)印跡雜交確定的基因組拷貝數(shù)目揭示了顆粒－感染比率對于表達(dá)gfp的載體在Ad感染的Hela細(xì)胞中大約是100。這樣這些實(shí)驗(yàn)獲得的最高得率大約是每個細(xì)胞1.36´104 DNase抗性基因組。這些實(shí)驗(yàn)表明了pSH3和pSH5質(zhì)粒完全支持無Ad共轉(zhuǎn)染情況下高效率的rAAV包裝。

3.2. Rep和Cap蛋白質(zhì)表達(dá) 為了表明輔助質(zhì)粒能表達(dá)AAV蛋白質(zhì)，293細(xì)胞共轉(zhuǎn)染了TR-UF5和不同的輔助質(zhì)粒，如2.2部分所述。將這些培養(yǎng)物轉(zhuǎn)染48小時后收獲、裂解并用SDS-PAGE和免疫印跡分析。用Rep特異性抗體分析Rep蛋白質(zhì)的表達(dá)(Fig.2A)發(fā)現(xiàn)pAAV/Ad(4和5道)的表達(dá)顯著低于pSH3(6和7道)或pSH5（8和9道）(1:3或1:5比例使用)的蛋白質(zhì)水平。在Fig.2A中，我們只指出Rep78和Rep52的位置，因?yàn)镽ep68與一個交叉反應(yīng)蛋白質(zhì)共遷移(在Rep78下可以看到)而Rep40的水平太低不能在核提取物中檢測到。用Cap特異性的抗體分析Cap表達(dá)(Fig.2表明當(dāng)使用pSH3和pSH5輔助質(zhì)粒與pAAV/Ad相比Cap表達(dá)顯著增高。正如所預(yù)料的，在pTR-UF5（第2道）和pCDMRep（第3道）轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)物中沒有capsid表達(dá)。更高水平的Cap蛋白質(zhì)可以解釋為pSH3和pSH5產(chǎn)生的rAAV的產(chǎn)率顯著高于pAAV/Ad的。其它表明Cap表達(dá)水平對于rAAV的產(chǎn)率是有限的(Vincent等,1997;Li等,1997)。盡管來自pSH3和pSH5的Rep78水平顯著高于來自pAAV/Ad，但我們沒有發(fā)現(xiàn)載體產(chǎn)率的減小。Rep78的過表達(dá)表明對rAAV的產(chǎn)出有限制(Li等，1997；Vincent等,1997)。另外，在pSH3和pSH5的AAV蛋白質(zhì)表達(dá)方面沒有顯著差別。

3.3.病毒DNA分析 為了分析這些新包裝質(zhì)粒所產(chǎn)生載體的量和類型，我們共轉(zhuǎn)染了pTR-UF5質(zhì)粒和不同的輔助質(zhì)粒，如2.2部分所述。轉(zhuǎn)染48小時后，收獲細(xì)胞，分離染色體外DNA。低分子量的DNA被DpnI(降解未復(fù)制的質(zhì)粒DNA)消化。消化后的DNA用瓊脂糖凝膠電泳和gfp特異的探針(Fig.3A)或AAV特異的探針(Fig.3進(jìn)行Southern雜交。在所有含有Rep蛋白質(zhì)的DNA樣品中都發(fā)現(xiàn)存在AAVRFM和RFD (Fig.3A: 2－8道)。復(fù)制的載體DNA水平在pAAV/Ad（Fig.3A，3和4道）pSH3或pSH5（Fig.3A，pSH3 5和6道，pSH4 7和8道）被用作輔助質(zhì)粒時幾乎是相同的。一個相似的膜被探針探測找有復(fù)制能力AAV，當(dāng)使用的是pAAV/Ad時(Fig.3B，3和4道)發(fā)現(xiàn)了復(fù)制的DNA，但pSH3和pSH5被用作輔助質(zhì)粒時卻沒有發(fā)現(xiàn)(Fig.3B，5和6道)。這些結(jié)果表明pSH3/5輔助質(zhì)粒完全支持AAV載體DNA復(fù)制，但是與pAAV/Ad輔助質(zhì)粒相比產(chǎn)生的rcAAV較少。 3.4. 有復(fù)制能力AAV的分析 盡管pAAV/Ad和pTR-UF5之間沒有顯著的同源性，有復(fù)制能力的AAV能夠通過載體質(zhì)粒和pAAV/Ad中rep和cap基因兩側(cè)的Ad末端之間的重組生成(Allen等,1997;Wang等,1998)。為了評估從輔助和載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染生成的rcAAV的水平，Ad感染的293細(xì)胞感染了不斷增加的m.o.i的野生型AAV或rAAV-gfp載體。轉(zhuǎn)導(dǎo)2天后，分離低分子量病毒DNA，用放射標(biāo)記AAV探針Southern雜交分析。當(dāng)106 293細(xì)胞被感染了m.o.i為10-3（大約104基因組）野生型病毒時， AAV DNA被發(fā)現(xiàn)(Fig.4, 2道)。當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)以用pAAV/Ad包裝質(zhì)粒制備的rAAV-gfp時，復(fù)制能力的AAV也被發(fā)現(xiàn)(Fig.4, 7道)。在Ad感染的細(xì)胞傳代一次后，來自一個pAAV/Ad包裝實(shí)驗(yàn)的rcAAV數(shù)量在104和105顆粒之間(由基因組拷貝數(shù)目所確定)。然而，在4個不同小規(guī)模rAAV-gfp制備中沒發(fā)現(xiàn)有復(fù)制能力的AAV(Fig.4，8-11道)。利用相同的分析方式，從20´375px培養(yǎng)皿大規(guī)模制備rAAV b-gal載體時也沒有能夠發(fā)現(xiàn)rcAAV(Fig4 12－17道)。從這些凝膠中最大量的gfp載體(8.0´108顆粒)和最低量的野生型AAV（104顆粒）的分析，我們估計(jì)rcAAV污染的量小于每8.0´104載體顆粒一個基因組或載體濃度的0.00125%。隨后的小和大規(guī)模載體制備實(shí)驗(yàn)中，Ad感染的293細(xì)胞中2次傳代后分析了rcAAV污染，結(jié)果沒有檢查到污染。

4．討論

從AAV 獲得的基因治療載體正被廣泛應(yīng)用于各種獲得性疾病和遺傳疾病。AAV載體的增殖被生成載體所需的耗費(fèi)體力的方法所阻礙。這里，我們描述了一種新型輔助質(zhì)粒的構(gòu)建和分析，它允許無Ad載體的生成，并顯著增加了重組載體的得率。輔助質(zhì)粒含有Ad的E4、E2a和VA RNA基因以及AAV rep和cap基因。當(dāng)導(dǎo)入到Ad E1a/E1b轉(zhuǎn)化的293細(xì)胞后，所有所需的Ad輔助基因都提供了，使有效的載體擴(kuò)增和包裝能夠進(jìn)行。相似的方法已經(jīng)有報(bào)道，Ad的輔助基因由質(zhì)粒轉(zhuǎn)染而不是病毒感染所提供(Grimm等,1998;Matsu***a等,1998;Xiao等,1998b)。完全沒有Ad的污染，且簡化了載體的純化。Grimm等(1998)描述了一個類似我們的Ad輔助質(zhì)粒的構(gòu)建并用于包裝的步驟。 用這種新輔助質(zhì)粒獲得了載體得率的增加。我們已經(jīng)獲得了超過每個轉(zhuǎn)染細(xì)胞100個gfp表達(dá)載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)單位。點(diǎn)雜交分析揭示這與每個細(xì)胞超過104載體基因組的得率相對應(yīng)。我們認(rèn)為從pAAV/Ad質(zhì)粒改進(jìn)的pSH3/5輔助質(zhì)粒的載體包裝系統(tǒng)是由于(1)更高水平的AAV蛋白質(zhì)表達(dá)(Fig.2)和(2)只導(dǎo)入2個試劑(載體和輔助質(zhì)粒)到培養(yǎng)細(xì)胞中而不是3個試劑(Ad感染，載體和輔助質(zhì)粒)。我們的新質(zhì)粒比pAAV/Ad表達(dá)更多的Cap蛋白質(zhì)，它可能完全解釋載體產(chǎn)量的增加。據(jù)報(bào)道，高水平的Rep78表達(dá)會抑制載體的生成(Li等，1997；Vincent等，1997)。然而實(shí)驗(yàn)中來自pSH3/5的Rep78積聚水平比來自pAAV/Ad 的高，但來自pSH3/5的載體產(chǎn)出卻更高。很明顯，來自pSH3/5增加的Cap表達(dá)足以克服Rep78的抑制。早期AAV的研究估計(jì)每個感染的細(xì)胞能產(chǎn)生105-106基因組和104-105組織培養(yǎng)感染單位(Parks等,1967；Rose和Koczot，1972)。因此具有有進(jìn)一步改進(jìn)此載體系統(tǒng)的潛力。一個可能增加載體產(chǎn)出的修飾是用ACG替代ATG啟動密碼子以減少Rep的表達(dá)，它可以有效地增加載體產(chǎn)出(Li等，1997)。 另外一個AAV包裝系統(tǒng)困擾載體生成的局限性是rcAAV的生成。盡管在大多AAV載體和輔助質(zhì)粒之間不存在大范圍 (>8bp)的同源性，rcAAV仍然因?yàn)榉峭�源性重組而產(chǎn)生(Allen等，1997;Wang等,1998)。我們的輔助質(zhì)粒含有與野生型病毒相同的AAV的cap和rep基因。因而，有可能由于非同源性重組產(chǎn)生rcAAV。然而，對我們的小規(guī)模和大規(guī)模制備進(jìn)行的分析都沒有發(fā)現(xiàn)任何rcAAV。Fig.4所示的實(shí)驗(yàn)是在Ad感染的Hela細(xì)胞后傳代1次獲得的結(jié)果。隨后，實(shí)驗(yàn)制備的載體在Ad感染的細(xì)胞中傳2次代未發(fā)現(xiàn)rcAAV。沒有rcAAV是這個系統(tǒng)的顯著優(yōu)勢，因?yàn)閞ep基因表達(dá)的病毒能夠影響體內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)果(Halbert等,1997)。 我們研制的輔助質(zhì)粒包括了一些以前發(fā)表的包裝系統(tǒng)的改進(jìn)。我們剔除了Ad的顛倒末端重復(fù)序列，它在pAAV/Ad輔助質(zhì)粒包裝AAV載體時表明產(chǎn)生了rcAAV(Wang等,1998)。通過將AAV rep和cap基因組裝到一個也含有Ad輔助基因的質(zhì)粒上，我們無需象其它系統(tǒng)一樣(Matsu***a等,1998；Xiao等,1998b；Grimm等，1998)需要一個3個質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。Grimm等(1998)研制了一個類似的系統(tǒng)在同一質(zhì)粒上攜帶AAV和Ad早期基因，并產(chǎn)生了相似水平的載體�？傊�，我們開發(fā)了一個改進(jìn)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)來生成重組AAV載體。載體生成的簡捷、載體得率的提高以及沒有rcAAV 或Ad污染使得這個系統(tǒng)對于臨床前期篩選多載體構(gòu)建特別有用。

持續(xù)發(fā)布中......