·簡(jiǎn)單的一套的標(biāo)準(zhǔn)品就可以滿(mǎn)足凝膠可視、膜定位和時(shí)間分辨熒光檢測(cè) 

·蛋白質(zhì)都已經(jīng)被生物素標(biāo)記 

·可以檢測(cè)待測(cè)物的分子量 

·無(wú)需混勻和加熱

 

ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)梯是ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)檢測(cè)系統(tǒng)必不可少的一項(xiàng)組成。蛋白質(zhì)梯最初始是應(yīng)用于蛋白質(zhì)分子定量，凝膠電泳的可視化，已經(jīng)評(píng)估轉(zhuǎn)膜的過(guò)程。

 

ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)梯由7個(gè)生物素標(biāo)記的重組蛋白，以及3個(gè)預(yù)染的蛋白質(zhì)marker組成。實(shí)驗(yàn)通過(guò)在二抗階段加入銪標(biāo)記的鏈霉親和素，從而實(shí)現(xiàn)生物素標(biāo)記蛋白的檢測(cè)。標(biāo)記好的膜可以通過(guò)安裝在SpectraMax I3或SpectraMax Paradigm多功能酶標(biāo)儀上的ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)檢測(cè)卡盒進(jìn)行讀取。

 

ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)梯： ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)梯包含7個(gè)生物素標(biāo)記的重組蛋白，分子量分別為10、20、40、50、80、100和140KD。它們的檢測(cè)是通過(guò)將膜與銪標(biāo)記的鏈霉親和素一起孵育，并在ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)檢測(cè)系統(tǒng)上以亮顏色條帶顯示（圖表1，左邊）。另外，這里還包括三個(gè)可見(jiàn)的預(yù)染好的marker，分別是18、31和70KD（圖表1，右邊）。這些藍(lán)色的條帶在電泳的膠條上、在轉(zhuǎn)膜后都清晰可見(jiàn)。它們?cè)赟canLater免疫印跡蛋白質(zhì)檢測(cè)系統(tǒng)上也會(huì)呈現(xiàn)暗色的條帶。我們通過(guò)圖表2上所示的實(shí)驗(yàn)比較了一組參照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以此來(lái)確定生物素標(biāo)記階梯蛋白的分子量與它們?cè)谀z條上的遷移距離的線(xiàn)性關(guān)系。

 

 

 

圖1: ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)梯。白色的條帶表示用于檢測(cè)膜上蛋白分子量的生物素標(biāo)記的蛋白。在和銪標(biāo)記的鏈霉親和素孵育后，便可用ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行讀取。暗色的條帶是預(yù)染蛋白，用以監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)電泳、雜交定位和轉(zhuǎn)膜效率。在這些過(guò)程中，這些藍(lán)色的條帶都是肉眼可見(jiàn)的。

圖2：遷移vs分子量。將7個(gè)蛋白在ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)梯上的遷移距離繪制及擬合為各自的分子量的函數(shù)。其線(xiàn)性關(guān)系與購(gòu)置于Sigma公司的參照蛋白（貨號(hào).#B2787）結(jié)果相類(lèi)似。

 

ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)檢測(cè)的流程在進(jìn)行二抗孵育以前，都參照標(biāo)準(zhǔn)的跑膠和轉(zhuǎn)膜方法。然后隨著目標(biāo)蛋白樣本，在膠條的一列加入4ul  ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)梯。不需要額外的加熱或其他準(zhǔn)備步驟。在與一抗孵育后，進(jìn)行封閉和洗膜，然后都以1:5000孵育銪標(biāo)記的鏈霉親和素和銪標(biāo)記的二抗。銪標(biāo)記的鏈霉親和素結(jié)合在蛋白階梯上，然后銪標(biāo)記的二抗特異性的結(jié)合在連接目的蛋白的一抗上。標(biāo)記好的膜可以通過(guò)安裝在SpectraMax I3或SpectraMax Paradigm多功能酶標(biāo)儀上的ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)檢測(cè)卡盒進(jìn)行讀取，這種卡盒是利用了時(shí)間分辨熒光技術(shù)（TRF）檢測(cè)銪元素。時(shí)間分辨熒光檢測(cè)可以顯著降低自發(fā)熒光、或者其他半衰期較短的發(fā)射光的背景噪音。同時(shí)也有效避免了化學(xué)發(fā)光和傳統(tǒng)熒光檢測(cè)中常出現(xiàn)的過(guò)曝情況；因此這個(gè)體系可以提供高信噪比的尖銳條帶。由于這個(gè)方法不涉及酶反應(yīng)，消除了蛋白定量中的固有變異性。另外，因?yàn)殇B元素有抗光漂白作用，所以膜上的信號(hào)可以保持?jǐn)?shù)周到一個(gè)月，并可以反復(fù)進(jìn)行讀取。ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)檢測(cè)系統(tǒng)，包括ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)梯，作為一種簡(jiǎn)單、靈敏和穩(wěn)定的檢測(cè)平臺(tái)，給多功能酶標(biāo)儀提供了出色的蛋白質(zhì)分析能力。

 

以下兩種分別檢測(cè)白介素-17和熱休克蛋白的實(shí)驗(yàn)，都為ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)梯如何進(jìn)行蛋白質(zhì)分子量評(píng)估提供了很好的依據(jù)。

 

將白介素-17（IL-17）上樣在4-20%梯度凝膠的1X緩沖液中跑30分鐘。將ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)梯也放于相同的膠上。蛋白質(zhì)將會(huì)轉(zhuǎn)移到熒光膜上，并與抗大鼠的IL-17過(guò)夜孵育，然后孵育1:5000的ScanLater銪標(biāo)記抗大鼠IgG和1:5000的ScanLater銪標(biāo)記抗鏈霉親和素抗體。如圖3a所示，當(dāng)膜被清洗、晾干后，就可以通過(guò)安裝在SpectraMax I3多功能酶標(biāo)儀上的ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)檢測(cè)卡盒進(jìn)行讀取了。通過(guò)ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)梯確定IL-17的分子量為14KD，與實(shí)際發(fā)表的分子量15KD近似。

 

熱休克蛋白(HSP70)是當(dāng)細(xì)胞暴露在高于正常孵育溫度下誘導(dǎo)產(chǎn)生的。在這項(xiàng)研究中，我們將CHO-K1細(xì)胞和Hela細(xì)胞暴露在45攝氏度45-90分鐘，然后等6個(gè)小時(shí)后收集細(xì)胞提取物。最后將5ul提取物上樣在4-20%梯度凝膠中進(jìn)行電泳,4ulScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)梯也放于相同的膠上。轉(zhuǎn)膜后，對(duì)膜進(jìn)行封閉、清洗，并與抗小鼠的HSP70過(guò)夜孵育，然后孵育銪標(biāo)記抗小鼠IgG1小時(shí)。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中,蛋白階梯與抗銪標(biāo)記抗鏈霉親和素分開(kāi)孵育。如圖3 b中的反向圖所示,預(yù)染的標(biāo)準(zhǔn)品顯示灰白色條帶,因?yàn)槿旧�淬滅了時(shí)間分辨熒光信號(hào)。兩個(gè)細(xì)胞系顯示HSP70隨著溫度的增加而增加。根據(jù)ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)梯估計(jì)，相比之下表明蛋白HSP70分子量大約是70 KD。

 

 

ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)梯可以實(shí)現(xiàn)用亮條帶評(píng)估分子大�。▓D表1），同時(shí)可以為凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜和轉(zhuǎn)膜后提供可見(jiàn)的指標(biāo)。這個(gè)系統(tǒng)允許用戶(hù)使用為了他們的應(yīng)用而優(yōu)化過(guò)的電泳和免疫印跡流程。孵育時(shí)建議使用銪標(biāo)記抗鏈霉親和素和銪標(biāo)記的二抗的蛋白酶抑制劑，這樣當(dāng)使用SpectraMax I3多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行讀取時(shí)，可以有效降低蛋白階梯和目的條帶的時(shí)間分辨熒光檢測(cè)背景。圖像都利用SoftMax Pro軟件進(jìn)行采集，并且軟件可以集成導(dǎo)出到一個(gè)自定義的Excel中進(jìn)行定量分析。隨著ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)梯的引入，ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)檢測(cè)系統(tǒng)為多功能酶標(biāo)儀提供了更加出色的靈敏度和蛋白質(zhì)分析能力。