為了滿足針對耐藥性微生物治療不斷增長的需求，開發(fā)出了基于競爭的自適應(yīng)進(jìn)化篩選方法。這種方法存在的一個(gè)難題就是如何從一個(gè)多樣性的微生物克隆庫中找到高價(jià)值的菌株，篩選到適合下游藥物開發(fā)，能夠產(chǎn)生新型抗生素的最好候選菌株。

 

對于從克隆庫中篩選抗生素產(chǎn)生菌株來說，通常使用瓊脂平板抑菌圈或透明圈篩選法。具有抗性的克隆可以產(chǎn)生并分泌對平板微生物具有抑制作用的代謝產(chǎn)物，因此在克隆周圍產(chǎn)生了透明圈，根據(jù)透明圈的大小可以準(zhǔn)確地從克隆庫中篩選出這些菌株。透明圈的直徑和抗性代謝產(chǎn)物產(chǎn)量一般成正比例關(guān)系。因此，高價(jià)值的菌株通常產(chǎn)生直徑最大的透明圈。這些克隆被篩選出來用于進(jìn)一步的特性研究和藥物開發(fā)。

 

如果使用人工篩選并挑取產(chǎn)生抑菌圈的克隆，整個(gè)過程不但慢、煩瑣，而且易出錯(cuò)。為了解決這些問題，Molecular Devices開發(fā)出了QPix400系列微生物克隆篩選系統(tǒng)，提供了高通量自動(dòng)化克隆篩選和挑取平臺(tái)，具有無與倫比的性能和效率。這里我們詳細(xì)描述了如何使用這個(gè)系統(tǒng)以及軟件模塊客觀篩選并挑取高價(jià)值的透明圈產(chǎn)生菌株。

 

·適用于各種適應(yīng)性進(jìn)化方面的應(yīng)用

·加快新型耐藥菌株感染治療方法的開發(fā)速度

·用戶自定義軟件參數(shù)，發(fā)現(xiàn)獨(dú)特的生物學(xué)特性

·通過可靠的自動(dòng)化解決方案篩選高價(jià)值克隆

 

Streptomyces clavuligerus可以產(chǎn)生超過20種具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物。包括許多B-內(nèi)酰胺類抗生素，如cephamycin C、cephalosporin C、clavulanic acid等。這里使用Streptomyces clavuligerus(ATCC 27064)作為模式生物，演示針對E.coli (Migula, Castellani and Chalmers ATCC 47076)的抑菌圈的識(shí)別和挑取。兩個(gè)菌株都從ATCC獲得，使用TSB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。液體培養(yǎng)階段使用搖床培養(yǎng)1-3天，相應(yīng)的S. clavuligerus在30℃，E.coli在37℃培養(yǎng)。S. clavuligerus經(jīng)過培養(yǎng)后，稀釋培養(yǎng)液OD600值在0.10-0.13之間，取2ul培養(yǎng)液點(diǎn)到TSA瓊脂板上，28℃培養(yǎng)3-5天。S.clavuligerus在TSA平板生長后，經(jīng)過稀釋的E.coli培養(yǎng)液被均勻地涂布到平板上，確保E.coli完全環(huán)繞并接觸到每個(gè)S.clavuligerus克隆。平板28℃繼續(xù)培養(yǎng)1 - 2 天， 并每天觀察。如圖1 所示，S.clavuligerus克隆產(chǎn)生針對E.coli的抑菌圈。

 

 

使用QPix400系統(tǒng)的抑菌圈識(shí)別軟件模塊對平板進(jìn)行白光成像，如圖2所示，軟件識(shí)別具有透明圈的克隆。高級的軟件算法應(yīng)許用戶自定義篩選參數(shù)，篩選并挑取符合特定要求的抑菌圈，如克隆大小、抑菌圈直徑、克隆直徑、軸比以及克隆邊緣形狀等（圖2）。

 

 

接下來，軟件選擇的可以產(chǎn)生抑菌圈的克隆以縮略圖的形式排列。克隆可以以多種順序進(jìn)行排列，比如總的透明區(qū)域大小、克隆大小、軸比、邊緣形狀等（圖3）。軟件自動(dòng)列出了每個(gè)產(chǎn)生抑菌圈克隆的詳細(xì)定量數(shù)據(jù)，方便隨時(shí)查看。

 

 

 

為了進(jìn)一步驗(yàn)證基于克隆庫或者自適應(yīng)進(jìn)化的自動(dòng)抑菌圈識(shí)別和篩選方法的效果，篩選了點(diǎn)有多樣微生物克隆庫的QTrays培養(yǎng)板。專用的軟件模塊從QTray上長出的48個(gè)克隆中準(zhǔn)確篩選出了3個(gè)產(chǎn)生抑菌圈的克隆(如圖4)。這種方法可以實(shí)現(xiàn)高通量有目的性地從一個(gè)大的微生物克隆庫中篩選、識(shí)別和挑取產(chǎn)生透明圈的克隆。

 

 

市場需要不斷開發(fā)出新型抗生素用于治療耐藥菌感染引起的疾病。為了開發(fā)新型抗生素或者微調(diào)抗生素的生物合成途徑，國內(nèi)外科研人員付出了許多的努力。基于克隆庫篩選或者基于競爭性自適應(yīng)進(jìn)化都可以用于產(chǎn)生廣譜抗生素過量產(chǎn)生菌株。

 

使用QPix400系列微生物克隆篩選系統(tǒng)以及QPix抑菌圈軟件識(shí)別模塊，我們可以輕松并且可靠地進(jìn)行高通量篩選透明圈產(chǎn)生克隆。這個(gè)自動(dòng)化的篩選方法將大大增加我們尋找新型抗生素的能力，用于應(yīng)對已有的或者新出現(xiàn)的抗生素耐藥菌引起的疾病。