——western blot技術(shù)在蛋白定量分析中的選擇應(yīng)用

蛋白質(zhì)印跡(western blot)，它是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。western blot 是在凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)。由于免疫印跡(western blot)具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)。免疫印跡(western blot)常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。

如何選擇蛋白印跡成像與定量分析技術(shù)？通常，Western Blot顯色的方法主要有以下幾種：1、放射自顯影；2、ECL；3、底物熒光ECF；4、底物DAB呈色等。下面我們將分別對這四種方法進(jìn)行介紹，同時(shí)向大家呈現(xiàn)每種方法的應(yīng)用特點(diǎn)。

放射自顯影radioautography：利用放射性核素發(fā)射的射線，使感光材料中的鹵化銀等感光，顯出影像后進(jìn)行放射性標(biāo)記物的定位和定量測量的技術(shù)。此技術(shù)的特點(diǎn)是靈敏度高、分辨率好、保存時(shí)間長久，但由于實(shí)驗(yàn)所用方式性物質(zhì)對人體有輻射作用，目前該技術(shù)在蛋白研究中應(yīng)用較少，多用于研究標(biāo)記化合物在機(jī)體、組織和細(xì)胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機(jī)理、作用部位等等。

底物DAB呈色：二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine,DAB）是辣根過氧化物酶最敏感、最常用的顯色底物，反應(yīng)產(chǎn)物因不溶于水、二甲苯和醇的棕色沉淀物而被廣泛地用于蛋白印跡（Western Blot,WB)、免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry,IHC)和免疫細(xì)胞化學(xué)(Immunocytochemistry,ICC)、斑點(diǎn)印跡(Dot blot)和生物芯片(Biochip)等的染色和顯色反應(yīng)。用之進(jìn)行對底物顯色即被稱為底物DAB呈色法。此技術(shù)成本低，操作也較簡單是常用的western blot成像分析技術(shù)之一，不過由于其靈敏度稍低，在目的蛋白表達(dá)量較少的情況下可能沒有理想的結(jié)果應(yīng)慎用。

底物化學(xué)發(fā)光ECL：化學(xué)發(fā)光是在一些特殊的化學(xué)反應(yīng)中吸收了反應(yīng)釋放的化學(xué)能,而處于電子激發(fā)態(tài)的反應(yīng)中間體或反應(yīng)產(chǎn)物由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)所產(chǎn)生的一種光輻射,化學(xué)發(fā)光分析是根據(jù)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物的光輻射(化學(xué)發(fā)光)確定物質(zhì)含量的一種痕量分析方法。它的特點(diǎn)是靈敏度高和線性范圍寬，不需要任何光源。

傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光檢測方法通常需要膠片成像，膠片成像可以保證較高的靈敏度，但也有很多缺點(diǎn)：耗時(shí)，需要暗房和顯影劑，膠片很貴，而且需要很多消耗品，需要持續(xù)購買。另外，用膠片上的蛋白條帶進(jìn)行定量也是幾乎不可能，和目測一塊考馬斯藍(lán)染的膠沒什么區(qū)別，而且膠片成像時(shí)間只能預(yù)先設(shè)定，如果曝光過度或者不足則需要再次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，非常麻煩。

數(shù)字成像系統(tǒng)的出現(xiàn)極大克服了傳統(tǒng)膠片法的一些弊端，近年來隨著冷卻CCD技術(shù)的發(fā)展，數(shù)字成像系統(tǒng)成本越來越低，成像效果同時(shí)獲得大大提升，因而CCD成像系統(tǒng)逐漸成為了實(shí)驗(yàn)室Western Blot的主要設(shè)備。同時(shí)目前很多Western blot的新技術(shù)也都是針對CCD成像系統(tǒng)的，目前CCD成像系統(tǒng)的靈敏度已經(jīng)可以達(dá)到甚至超過傳統(tǒng)的膠片成像。冷卻型CCD照相機(jī)與X膠片相比具有瞬時(shí)影像處理、高靈敏度、高分辨率、動(dòng)力學(xué)范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，而且還不需要膠片處理裝置、后續(xù)耗材投入及暗室。

底物熒光ECF：是利用的熒光染料（如Cy2 ,Cy3, Cy5）標(biāo)記二抗，標(biāo)記熒光染料的二

抗分別對應(yīng)相應(yīng)的目的蛋白，以此實(shí)現(xiàn)通過檢測熒光染料的信號強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)種蛋白信號的檢測，以進(jìn)行精確的定量分析。熒光檢測Western Blot本來不是檢測的主流方法，不過熒光法檢測允許在同一張轉(zhuǎn)印膜上用不同顏色的熒光底物同時(shí)檢測不同的目標(biāo)。

在做western blot的檢測時(shí)，有時(shí)會(huì)碰到電泳后兩個(gè)分子量相近的蛋白分離不開，距離相近或者重疊，例如磷酸化和非磷酸化的蛋白；或者是同一次實(shí)驗(yàn)中，檢測一種以上的蛋白抑或是利用內(nèi)參蛋白對目的蛋白的定量分析進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。遇到以上這樣的實(shí)驗(yàn)需求，化學(xué)發(fā)光的檢測方法會(huì)顯得繁瑣復(fù)雜，其必須經(jīng)過剝脫抗體和重行孵育新抗體的過程，不僅耗時(shí)費(fèi)力，而且不能進(jìn)行精確的定量分析，由此多色熒光成像的技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。多色熒光成像，是利用不同的熒光染料（如Cy2 ,Cy3, Cy5）標(biāo)記二抗，標(biāo)記不同熒光染繞的二抗分別對應(yīng)不同的目的蛋白，以此實(shí)現(xiàn)通過檢測不同熒光染料的信號強(qiáng)度，間接實(shí)現(xiàn)一次實(shí)驗(yàn)可檢測多種蛋白，同時(shí)也可以進(jìn)行精確的定量分析。

根據(jù)這一應(yīng)用需求，美國著名的成像技術(shù)公司Alpha Innotech公司推出的Fluorchem Q 成像系統(tǒng)，是凝膠成像專家Alpha Innotech公司秉承其銳意創(chuàng)新的精神，憑借其近20年來豐富的成像經(jīng)驗(yàn)而推出的集化學(xué)發(fā)光成像，多色熒光成像，可見光成像多種功能于一體的高端成像系統(tǒng)。 其420萬像素，0.95 大光圈鏡頭保證了其靈敏的化學(xué)發(fā)光成像，雙反射高強(qiáng)度三色LED燈及透射紫外光源可實(shí)現(xiàn)多達(dá)5種熒光染料的檢測， 以及其特制的低背景樣品架都保證了其出眾的多色熒光成像性能。Fluorchem Q除了擁有出色的硬件配置，其簡便、快捷、流水線設(shè)計(jì)的Alphaview Q軟件更是無人出其右, Alphaview Q軟件具有多通道熒光成像程序，即可自動(dòng)切換激發(fā)光源和濾光片，完成多通道熒光圖像的的拍攝。獨(dú)特的channel view功能，可以單獨(dú)觀察每個(gè)熒光通道的圖像；流水線式的定量分析多色熒光條帶或斑點(diǎn)。

總之，經(jīng)典的western blot技術(shù)結(jié)合不斷進(jìn)步的科學(xué)技術(shù)，使蛋白定量分析更靈敏、操作更加簡便。同時(shí)，western blot技術(shù)儀器也更加專一、高效，這就要求我們在開展western blot實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要就如何選擇蛋白印跡成像與定量分析技術(shù)進(jìn)行選擇確定，以保證選擇工具的適用性。