Real time PCR mRNA 定量實(shí)驗(yàn)路線選擇F&Q
Real time PCR mRNA 定量實(shí)驗(yàn)路線選擇F&Q
問題一：Real time PCR mRNA的相對(duì)定量和絕對(duì)定量的選擇；
測(cè)定mRNA, 一般采用相對(duì)定量，因?yàn)榻^對(duì)定量，標(biāo)準(zhǔn)品的制備和定量是有難度的，具體可以參考這篇文獻(xiàn)：http://www.biotnt.com/news/news_105.htm；
“Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 22DDCT Method”
Kenneth J. Livak* and Thomas D. Schmittgen
Applied Biosystems, Foster City, California 94404; and †Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy
Washington State University, Pullman, Washington 99164-6534
Kenneth J. Livak* and Thomas D. Schmittgen
Applied Biosystems, Foster City, California 94404; and †Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy
Washington State University, Pullman, Washington 99164-6534
問題二：Real time PCR 的染料法和探針法的選擇；
答：進(jìn)行mRNA表達(dá)量的測(cè)定，采用染料法是比較經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的；染料法可以通過比較熔解曲線的熔解峰位置得到產(chǎn)物特異性的情況；目的基因和內(nèi)參基因分管檢測(cè)；
染料法可以選用Real time 染料PCR PreMIX，A2010A0112，A2010A0112-2，A2010A0112-3（）
探針法主要應(yīng)用于病毒RNA的檢測(cè)；以及單位點(diǎn)突變（SNP）；多基因的合并檢測(cè)；舉例：
如果某mRNA 有多個(gè)亞型，很難找到一段擴(kuò)增產(chǎn)物都一致的部分來設(shè)計(jì)引物，用探針法可以通過僅找到同源處設(shè)計(jì)引物和探針的方式，進(jìn)行多基因的合并檢測(cè)；但如果用染料法，可能得到的產(chǎn)物有多個(gè)，熔解曲線非單峰，檢測(cè)的數(shù)據(jù)就很難看；這種情況，適用探針法；探針法還可用于同一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)目的基因和內(nèi)參基因的情況；而染料法則必須分管檢測(cè)。
探針法可以選用：熱啟動(dòng)Taqman-PCR PreMix試劑盒（探針）A2010A0103（http://www.biotnt.com/product/product_32234.html）；
熱啟動(dòng)Taqman-PCR探針法多重?zé)晒釶remix A2010A0114（）
一步RT-Real time PCR 探針法Premix，A2010A0115s，A2010A0115L()
問題三：Real time PCR 相對(duì)定量中標(biāo)準(zhǔn)曲線法和deltadelta CT法的選擇；
答：一般選擇deltadelta CT法；當(dāng)擴(kuò)增效率相差比較大的時(shí)候，可以采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行檢測(cè)和計(jì)算；
問題四：Real time PCR 相對(duì)定量中的標(biāo)準(zhǔn)曲線法如何進(jìn)行：
答：主要是相對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品的制作，一般有三種方法：
1、比較復(fù)雜的方法：質(zhì)粒
采用Biotnt 提供內(nèi)參基因的特異性real time PCR mRNA引物（custom primer pairs） （http://www.biotnt.com/product/product_32250.html），對(duì)目的基因進(jìn)行real time PCR實(shí)驗(yàn)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)入質(zhì)粒中，得到相對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)品；
2、一般采用的方法1：比較強(qiáng)的CDNA 模板
采用Biotnt 提供內(nèi)參基因的特異性real time PCR mRNA引物（custom primer pairs） （http://www.biotnt.com/product/product_32250.html），對(duì)目的基因進(jìn)行real time PCR實(shí)驗(yàn)，選擇比較強(qiáng)的CDNA 模板，一般CT要在20-25之間，對(duì)這個(gè)CDNA 進(jìn)行5倍的梯度稀釋，一般稀釋四到五個(gè)點(diǎn)；對(duì)梯度稀釋的CDNA 進(jìn)行real time PCR，以CT值為縱坐標(biāo)，橫坐標(biāo)為CDNA 模板的相對(duì)濃度取對(duì)數(shù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3、一般采用的方法：PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物
如果在方法2中找不到比較強(qiáng)的CDNA 模板，則選用PCR 產(chǎn)物作為相對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)品也是可以的；需要注意的事項(xiàng)是：PCR 產(chǎn)物濃度很高，而real time PCR的產(chǎn)物片段比較短，容易在稀釋的過程中造成PCR污染，要注意操作。
一般PCR 產(chǎn)物在稀釋一萬倍以后，作為模板加入1ul到體系中，這時(shí)候的CT在10個(gè)循環(huán)左右，所以建議對(duì)PCR模板一萬倍的，做100倍稀釋，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；
注：標(biāo)準(zhǔn)曲線一般要跨過您要檢測(cè)的樣本的CT，才能比較精確的進(jìn)行定量；
標(biāo)準(zhǔn)品盡量分布在您樣本CT的附近；所以，標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋倍數(shù)，不一定是要一樣的；
問題五：Real time PCR mRNA相對(duì)定量中內(nèi)參的選擇；
答：一般選擇beta-actin， GAPDH ，18sRNA 等相對(duì)豐度比較均一的基因作為內(nèi)參基因；
也可以根據(jù)參考文獻(xiàn)選擇內(nèi)參基因；
Biotnt 提供內(nèi)參基因的特異性real time PCR mRNA引物（custom primer pairs） （http://www.biotnt.com/product/product_32250.html）
嚴(yán)格的選擇內(nèi)參基因的方式應(yīng)該有如下步驟：
1、 針對(duì)您要檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)組選擇部分有代表性樣本；
2、 統(tǒng)一抽提RNA；
3、 測(cè)定RNA 含量；選擇同一量的RNA去進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；
4、 確定備選的內(nèi)參基因，準(zhǔn)備內(nèi)參基因的引物；得到最優(yōu)體系；
5、 測(cè)定轉(zhuǎn)錄后的CDNA各個(gè)備選的內(nèi)參基因的CT值；
6、 計(jì)算每個(gè)備選的內(nèi)參基因的平均CT，SD 和CV；
7、 選擇CV比較小的作為合格的內(nèi)參基因；
8、 如果多個(gè)備選內(nèi)參基因的CV都比較小，則您的實(shí)驗(yàn)對(duì)內(nèi)參的影響就比較��；建議選擇與您的目的基因CT相對(duì)比較接近的備選內(nèi)參基因作為實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參基因。
問題六：Real time RT-PCR 中逆轉(zhuǎn)錄采用兩步法還是一步法的選擇；
答：
如果您同時(shí)要檢測(cè)多個(gè)目的基因，通常建議您采用兩步法，即先使用mRNA CDNA第一鏈合成試劑盒（），得到CDNA; 然后采用Biotnt 熒光定量PCR Premix試劑盒(熒光染料)（http://www.biotnt.com/product/product_32252.html）和特異性real time PCR mRNA引物（custom primer pairs） （http://www.biotnt.com/product/product_32250.html），進(jìn)行多基因的同時(shí)檢測(cè)，可以實(shí)驗(yàn)高通量和高效率；最多進(jìn)行多基因的同時(shí)檢測(cè)；最多可以在一塊96孔板上進(jìn)行48個(gè)基因的雙重復(fù)檢測(cè)；
如果您要檢測(cè)的基因含量特別低，或者樣本很難抽提，或者引物特別難設(shè)計(jì)，可以采用Real time RT-PCR 一步法的方案；即您抽提好的mRNA，采用一步RT-Real time PCR 染料法Premix A2010A0116L（），和特異性real time PCR mRNA引物（custom primer pairs） （http://www.biotnt.com/product/product_32250.html），就可以進(jìn)行real time PCR的mRNA 表達(dá)的相對(duì)定量研究；因?yàn)椴捎昧颂禺愋砸镞M(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，提高的檢測(cè)的特異性，消除了其他mRNA的干擾。
問題七：Real time RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄的引物，采用oligodT 還是隨機(jī)引物，還是特異性引物的選擇；
一般檢測(cè)mRNA， 通常是采用的oligodT 作為逆轉(zhuǎn)錄引物；對(duì)于mRNA的逆轉(zhuǎn)錄，特異性比較高；
特異性引物可用于已知特定序列的mRNA，或者其他要檢測(cè)的RNA（如病毒等），特異性最高；
隨機(jī)引物可用于不知序列的總RNA的逆轉(zhuǎn)錄，特異性最低；
問題八：Biotnt的RNA 抽提是采用的什么原理？
答：Biotnt的RNA 抽提采用的是Trizol法；（http://www.biotnt.com/product/product_32245.html）。Trizol是一種快捷方便的總RNA提取試劑，可以從動(dòng)物組織、各種微生物及細(xì)胞等樣本中提取總RNA。是如今實(shí)驗(yàn)室普通采用的方法。Biotnt 后期進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和real time PCR 實(shí)驗(yàn)所使用的RNA 無須進(jìn)行額外的純化。
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