miRNA qPCR Detection Primer Set（miRNA檢測試劑盒）實(shí)驗(yàn)說明
一、概述
1、介紹
microRNA(miRNA)是一類有大約22 個(gè)核苷酸組成的非編碼小分子RNA，其廣泛存在于真核生物中。miRNA 在個(gè)體發(fā)育的不同時(shí)期及不同組織中有不同的表達(dá)模式，都表明了其在發(fā)育和分化中起有重大的調(diào)控作用。迄今為此，對(duì)miRNA 的檢測方法主要有Northern Blot 等基于分子雜交的方法，這些方法敏感度低、耗時(shí)長、RNA 的用量較大。miRNA Q-PCR etection Kit采用了國際上公認(rèn)的核酸檢測標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)――Real-Time PCR 技術(shù)來對(duì)miRNA 進(jìn)行檢測，其具有快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。
2、實(shí)驗(yàn)原理
EzOmicsTM miRNA qPCR Detection Primer Set包含了miRNA特異的逆轉(zhuǎn)錄引物，以及qPCR正、反向引物套裝。其中莖凸環(huán)結(jié)構(gòu)狀的miRNA特異逆轉(zhuǎn)錄引物可特異性的轉(zhuǎn)錄成熟的miRNA。再利用高度特異的正反向引物，使miRNA定量即靈敏又高度特異。
EzOmicsTM miRNA qPCR Detection Primer Set提供了一種最低能檢測到5個(gè)拷貝目標(biāo)miRNA的高靈敏度的檢測方法，并且具有一個(gè)7 個(gè)數(shù)量級(jí)的動(dòng)態(tài)變化范圍，反應(yīng)的模板可以是總RNA或者已純化的小RNA等。
3、產(chǎn)品內(nèi)容
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名稱 |
介紹 |
量 |
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RT Primer |
miRNA Reverse Transcription Primer |
2 nmol |
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Forward Primer |
miRNA Forward Primer |
2 nmol |
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Revers Primer |
Universal Reverse Primer |
2 nmol |
二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、客戶需自己提供實(shí)驗(yàn)試劑
一步法或兩步法qPCR mix，反轉(zhuǎn)錄酶，RNA 酶抑制劑，DEPC-H2O 等
2、耗材準(zhǔn)備
無RNase，DNase 的吸頭，離心管等
3、引物準(zhǔn)備
引物為干粉形式，需先離心，后每管加入200 μL DEPC-H2O稀
釋至10μM，混勻后于-20oC凍存?zhèn)溆?/FONT>
4、儀器準(zhǔn)備
離心機(jī)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀等
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1．兩步法擴(kuò)增
先將miRNA做反轉(zhuǎn)錄miRNA cDNA，然后再進(jìn)行qPCR定量
1.1 RT Primer Mix的配置
EzOmicsTM miRNA qPCR Detection Primer Set可以同時(shí)檢測50個(gè)以內(nèi)的miRNA分子。反轉(zhuǎn)錄之前，需預(yù)先配置RT Primer Mix(200nM)。如果需要用5S rRNA 或U6 snRNA 做內(nèi)參對(duì)照，需同時(shí)配置Random Primer或內(nèi)參的Reverse Prime做反轉(zhuǎn)錄引物。
1.2 逆轉(zhuǎn)錄體系
| 試劑 | 體積 | 終濃度 |
| RNA模板 | 0.2ng~1μg | 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求 |
| RT Primer Mix | 5 μl | 20nM |
| 10×RT Buffer | 5 μl | 1× |
| RNase inhibitor | 見試劑供應(yīng)商說明書 | |
| dNTP (2.5mM) | 4 μl | 200nM |
| 逆轉(zhuǎn)錄酶 | 見試劑供應(yīng)商說明書 | |
| DEPC-H2O | 補(bǔ)足至50μl |
1.3 逆轉(zhuǎn)錄程序
反應(yīng)完成后，將miRNA cDNA存放于-20℃（長期保存請(qǐng)分裝保
存于-80℃）。
1.4 miRNA實(shí)時(shí)定量 PCR反應(yīng)體系
1.5 實(shí)時(shí)定量 PCR反應(yīng)程序
2．一步法擴(kuò)增：
將miRNA反轉(zhuǎn)錄和qPCR定量兩個(gè)過程放在一個(gè)管子中進(jìn)行
2.1 一步法miRNA定量體系的建立
2.2 實(shí)時(shí)定量 PCR反應(yīng)程序
