UPLC SYNAPT 二級質譜方法用于 siRNA 寡核苷酸結構確證

Vera B. Ivleva 、 Ying Qing Yu 和 Martin Gilar

美國馬薩諸塞州米爾福德沃特世公司

簡介

RNA 干涉（ RNAi ）機制在轉錄后基因沉默中有根本性的作用，在已知序列的情況下，基因沉默常規(guī)實驗可通過使用 ~21 個核苷酸（ nt ）長度的合成 RNAi 探針進行，此法也用于研發(fā)藥物。

合成 RNAi 寡核苷酸須純化以防靶點外的基因沉默。 RNAi 藥物需要良好的實驗描述，以達到法規(guī)要求，將可能的安全有效性的不良作用降低到最小。

沃特世超高效液相色譜（ UPLC ® ）技術的高分離度色譜能力與質譜聯(lián)用分析是分析 siRNA 寡核苷酸等生物藥物的有力手段。作為寡核苷酸確證的一部分，可通過選擇性酶或化學物進行測序。二級質譜碎片分析方法為快速通用方法，可用于修飾后的寡核苷酸（通常對酶切有抵抗力）。為獲得完整的 21 核苷酸 RNAi 的結構信息，二級質譜分析中其分子須有效離子化并產(chǎn)生與序列相關的離子，質量精確性與分離度也需適當。

本應用手冊提供了精確 UPLC/MS/MS 分析方法用于 21 核苷酸 RNA 結構確證的流程。該法對確認 siRNA 堿基藥物的序列是非常有用的。

實驗條件

樣品制備

21 核苷酸長度的互補 RNA 鏈（上游序列 5’ -UCG UCA AGC GAU UAC AAG GTT -3’ ，下游序列 5’ -CCU UGU AAU CGC UUG ACG ATT -3’ ）在 0.1 M 乙酸三乙胺（ TEAA ）中分別重組。

合成副產(chǎn)物的分布與上下游序列一并通過 UPLC/MS 檢測。用于 UPLC/MS 分析的樣品濃度為 30 pmol/μL 。

方法

UPLC/MS 分析與前述一致。 1 沃特世 ACQUITY UPLC ® 系統(tǒng)適配了 ACQUITY UPLC 寡核苷酸分離技術（ OST ） C 18 柱（ 1.7 μm ， 2.1 x 50 mm ； PN 186003949 ），質譜參數(shù)的選擇旨在達到最佳 TEA 加合物的去聚集效果，而不影響先導離子強度。沃特世 SYNAPT™ HDMS™ 質譜在飛行時間 TOF ）模式下操作。

選擇離子的誘導解離碰撞能量梯度為 25 -55 V 。 MS/MS 碎片程度通過選擇合適的電荷狀態(tài)（ -3 到 -6 ）與不同的碰撞能梯度進行調整。產(chǎn)物離子譜在 500 -7000 m /z 范圍內進行采集，采集率為 1 次掃描 / 秒。負離子模式的外部校正使用了碘化銫。使用了 MaxEnt™3 軟件進行了數(shù)據(jù)分析前的圖譜去卷積。

LC 條件

LC 體系： 沃特世 ACQUITY UPLC 系統(tǒng)
色譜柱： ACQUITY UPLC OST C 18 1.7 μm ， 2.1 x 50 mm
柱溫： 60 °C
進樣量： 5 μL
流速： 0.2 mL/min
流動相 A ： 15 mM TEA ， 400 mM HFIP
流動相 B ： 50% A ， 50% 甲醇
梯度： 10 分鐘內 B 液含量從 20-40%

MS 條件

MS 系統(tǒng)： 沃特世 SYNAPT HDMS 系統(tǒng)
毛細管電壓： 2.7 V
樣品錐孔電壓： 31 V
提取錐孔電壓： 3 V
源溫度： 120 °C
脫溶劑氣溫度： 300 °C
脫溶劑氣流流速： 500 L /h
碰撞阱能量： 6 V
傳輸碰撞能量： 4 V
質量分辨率： V 模式下 ~ 9000 （ FWHH ）
LockMass ： CsI 10 mg/mL （水 - 異丙醇， 1 ： 1 ），流速為 5 μL/ 分鐘，掃描時間 1 秒，頻率 30 秒，設定質量 1685.765 m /z （ Cs 6 I 7 - ）

結果與討論

碰撞能量模式影響了 MS/MS 碎片產(chǎn)生的程度，能量值須根據(jù)對應分析物進行調整。一般來說，用于 21 核苷酸長度分析物 MS/MS 碎片化最廣的帶電狀態(tài)是 -5 與 -3 （ 1500 -2000 m /z 范圍內）。 25-45 V 的碰撞能梯度對 21 核苷酸 RNA 產(chǎn)生結構可用的碎片是合適的。

總體上，為獲得 MS/MS 碎片的合理的信噪比（ S/N ），總離子色譜圖（ TIC ）中主成分或污染物須具有最低 500 離子數(shù)的信號。

互補 RNA21 核苷酸鏈分別進樣至 UPLC/MS/MS 系統(tǒng)，色譜顯示了較短的寡核苷酸峰（ 5’ 水解產(chǎn)物），它們可以根據(jù)原目標 21 核苷酸得到很好的解析（圖 1 ）。成分峰的歸屬是根據(jù)其精確質量測量進行的，可確證部分序列。 1

為鑒定全核苷酸結構， 21 核苷酸下游鏈的先導離子 [M-4H] 4- 進行了分離與碎裂（圖 2 ）。主要的特征碎片是互補的 c 與 y 離子和 低強度 [a-B] 以及 w 離子（命名見圖 3 ）。上述 5’-P-O 斷裂 序列的離子是 RNA 寡核苷酸 MS/MS 分析的主要碎片，與 DNA 產(chǎn)生的產(chǎn)物（主要是 3’-C-O 斷裂的 [a-B] 與 w 離子） 不同。這是因為 DNA 分子缺乏 2’- 羥基。 2

雙鏈骨架斷裂產(chǎn)生的內部碎片與 c 離子的 胞嘧啶中性缺失（表 1 ）顯著較少，且對結構鑒定有意義的峰歸屬沒有貢獻。上游 21 核苷酸 RNA 的 MS/MS 分析，碰撞能梯度（ 30-50 V ）產(chǎn)生的結果近似（圖 2 ）。

圖 2 21 核苷酸 RNA 寡核苷酸的 MaxEnt3 去卷積 MS/MS 圖譜。星號為諧波峰（去卷積的結果）

MS/MS 的 [M-4H] 4- 圖譜中所有的碎片離子中， 21 個核苷酸的 RNA 通過幾種電荷狀態(tài)表示（表 1 ）。 MS/MS 圖譜的多電荷離子去卷積通過 MaxEnt 3 軟件進行，顯著降低了圖譜復雜性，簡化了 MS/MS 數(shù)據(jù)解讀。

去卷積圖譜已足夠用于解讀整個 siRNA 序列（圖 2 ），還檢測到了幾個代表了 21 核苷酸分子離子的 A ， G 與 C 氣相核堿基損失的峰。 LockMass 校正后質量精確度達到了 10 ppm 以下，對手工數(shù)據(jù)解析是很有用的（表 1 ）。三重四級桿質譜的質量分辨率與離子阱儀器可能不能足以進行特征碎片歸屬以區(qū)別多電荷峰與其他寡核苷酸復雜碎片產(chǎn)物。

結論

開發(fā)了通過精確質量 UPLC/MS/MS 進行可靠的測序，以用于 siRNA 寡核苷酸結構確證的方法。

•  SYNAPT HDMS 系統(tǒng)的高質量精確性與分辨率可達到清晰碎片離子歸屬要求。
•  可靠的 MS/MS 方法可產(chǎn)生特征離子碎片，覆蓋了較廣的質量范圍，足以用于 21 個核苷酸的 siRNA 序列的解析。
•  MaxEnt 3 去卷積軟件極大地降低了 MS/MS 圖譜的復雜性，簡化了序列解析過程。

本高效確證性測序法對依照美國 FDA 生物藥物化合物規(guī)定測定藥用寡核苷酸序列十分有用。本法還可能用于計算機測定未知雜質序列。可預計，本 MS/MS 方法可用于外切酶難以切斷的化學修飾寡核苷酸（階梯測序）。

自動化的 MS/MS 可減少數(shù)小時乃至幾天的分析時間，降低樣品分析成本。另外， UPLC 還可快速分離目標 RNA 類群，多種寡核苷酸鏈可同時進行 MS 與 MS/MS 分析。 UPLC 分離目標寡核苷酸與其被剪切產(chǎn)物的能力對于 siRNA 代謝研究是十分有利的。

參考文獻

1. UPLC/MS Analysts of Interfering RNA Oligonucleotides. Waterrs Application Note.2008 ： 720002412en.
2. Kirperkar F ， Krogh TN. Rapid Commun 。 Mass Spectrom 。 2001 ； 15 （ 1 ）： 8-14.
3. Adopted from McLuckey SA, et al. J. Am. Soc. Mass Spectrom 。 1992 ； 3 （ 1 ） 60-70.