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甲基化檢測——MS-HRM技術

瀏覽次數(shù):4005 發(fā)布日期:2010-7-14  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

HRM技術服務之甲基化檢測(MS-HRM技術)

    DNA甲基化是發(fā)生在DNA堿基序列上的一種共價修飾。在哺乳動物中,DNA甲基化主要發(fā)生在5'-CpG-3'雙核苷酸序列的胞嘧啶上。在人類基因組中,大約有60%~70%的CpG胞嘧啶是甲基化的,其程度因不同的物種和細胞類型而異。DNA甲基化狀態(tài)在基因組中呈現(xiàn)出一定的分布模式,90%的甲基胞嘧啶位于重復序列上。DNA甲基化可以遺傳,并改變了DNA的結構特性與基因活動方式。

DNA甲基化意義:

    靶序列上甲基基團的存在可以影響轉錄因子的結合,引起轉錄抑制,從而使該基因表達受到抑制。啟動子區(qū)CPG島的甲基化常?梢砸种圃摶虻霓D錄,尤其是對于抑癌基因,凋亡相關基因,DNA修復基因等,啟動子區(qū)域發(fā)生甲基化會影響功能的發(fā)揮。不同的腫瘤組織基因甲基化狀態(tài)不一樣,可以作為早期檢測,監(jiān)測腫瘤形成的重要標志物。對于某些特異基因的甲基化,更加重要,如DNA修復基因,可以引起對化療藥物的敏感,從而作為藥物治療療效的評價指標,指導臨床用藥。

檢測方法:

    甲基化特異性PCR、Northern印跡法、Western印跡法、免疫細胞化學等,這些檢測方法需要花費大量時間,成本高,在臨床推廣應用時均存在一定的困難。

    高分辨率熔解(High  Resolution Melt,HRM)是一種最新的在表觀遺傳學中檢測 CpG 位點的一種新技術,主要是根據(jù)DNA序列的長度、GC含量、堿基互補性差異和特定飽和染料可以插入DNA雙鏈中的特性,應用高分辨率的熔解曲線對樣品進行分析,其分辨精度可以達到對單個堿基差異的區(qū)分。

作為新一代的遺傳掃描工具,HRM具有“簡、效、快、廉”等其它技術難以比擬的優(yōu)勢:

簡:無需序列特異性探針,不受堿基位點局限,同時檢出已知或未知突變、SNP和甲基化位點;閉管操作,避免交叉污染。

效:最低檢測0.1%-0.01%的突變或異常甲基化,檢測SNP靈敏度和特異性均為100%。

快:1次同時檢測不多于384個樣本,在60-90分鐘內(nèi)完成檢測。

廉:簡化操作步驟、降低人工和試劑成本,費用遠少于測序、Taqman探針等方法。

    HRM技術特別適用于樣本量多、檢測位點較少的SNP、突變或甲基化分析,是不同于基因芯片檢測方法(檢測位點多,樣本少)的高通量方法。同時,也是基因芯片篩選后的多個基因在更多標本中驗證的最佳方法。

DNA甲基化-HRM檢測原理:

    甲基化敏感性高分辨率熔解曲線分析(MS-High Resolution Melting Curve Analyse)是一種不需要 PCR 產(chǎn)物后續(xù)操作的,簡單且靈敏的檢測基因甲基化水平的方法。該方法主要通過比較曲線的熔解溫度和峰形得以實現(xiàn)并且可以在一些列的 CpG 位點中檢測出單一的一個甲基化的發(fā)生,同時,也可以對一系列的 CpG 位點的甲基化水平進行分析。單個 CpG 位點的甲基化和平均的甲基化水平會對熔解曲線的形狀造成影響。采用重亞硫酸鹽處理 DNA 模板可以使 5-甲基胞嘧啶轉化為尿嘧啶。在PCR反應前,在非CpG島位置設計一對針對經(jīng)亞硫酸氫鈉處理后DNA 鏈的引物,這對引物中間包含有意義的甲基化CpG島,一旦這些CpG島發(fā)生甲基化,使胞嘧啶(C)不發(fā)生變化,而與未甲基化的胞嘧啶(C)轉變成胸腺嘧啶(T),樣品中的 GC 含量發(fā)生了變化,最終被轉化成了熔解曲線 Tm 值之間的差異。 CpG 位點在小的擴增片段內(nèi)的相對位置也會對熔解峰的形狀產(chǎn)生影響,因此, 根據(jù)Tm值和熔解峰的形狀可以檢測出樣本的甲基化位點和甲基化程度。

    HRM方法操作簡單、靈敏高、重復性高、成本低、不受檢測位點的局限高度等等優(yōu)勢,將對于遺傳學、腫瘤學等方面的研究和臨床應用提供更大的幫助。


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